热喀斯特多年冻土甲烷热点中挥发性有机物（VOCs）作为微生物活动早期指示剂的研究及其对气候反馈的启示

本研究深入探讨了北极热喀斯特多年冻土区甲烷（CH4）释放的微生物与化学驱动机制。通过实验室模拟冻融过程，结合甲烷通量测量、碳同位素（δ13C-CH4）分析、挥发性有机化合物（VOCs）谱分析和宏基因组学，揭示了甲烷释放的温度敏感性和深度依赖性。研究发现，甲烷八叠球菌属（Methanosarcina）是优势产甲烷菌，其代谢活动产生的VOCs特征可作为早期生物标志物，预警地下微生物激活和甲烷热点形成。研究强调了将此类生物地球化学指标纳入模型对改进多年冻土碳循环预测的重要性。

　　

背景

甲烷（CH₄）是大气中仅次于二氧化碳（CO₂）的重要长寿命辐射强迫因子，贡献了约16%的人为辐射强迫。湿地，包括正在融化的多年冻土区，是大气CH₄的主要贡献者，但由于生物地球化学和物理驱动因素的复杂性，对其排放的预测仍然存在不确定性。在北极多年冻土系统中，微生物和非生物对CH₄通量的控制仍然知之甚少。从生物学角度看，CH₄通量受产甲烷作用和甲烷氧化作用之间的平衡控制。土壤既是CH₄的源也是汇。然而，甲烷氧化途径仍然难以捉摸，特别是在寒冷、缺氧的土壤中。

在这些景观中，多年冻土退化导致异质的土壤条件——改变氧化还原动力学、碳可用性和微生物活动——这些难以仅使用传统指标来解析。传统测量方法，如融化深度、土壤温度、土壤湿度和总碳含量，提供了必要的基线信息，但在捕捉精细尺度的变异性或早期的生物地球化学转变方面能力有限。这些方法通常假设空间尺度上的同质性，可能会错过地下的“热点”或“热时刻”活动。因此，新兴的分子、同位素和代谢指标越来越被认为是传统环境监测的必要补充，为多年冻土融化的生物地球化学反馈提供了更早和更机械的见解。

微生物挥发性有机化合物（VOCs），作为初级和次级代谢的副产品，代表了微生物功能和群落变化的一个有前景的化学指纹。VOCs在土壤基质中扩散，可以反映代谢途径，如发酵、氨基酸分解代谢和厌氧碳降解。由于VOCs比许多水相代谢物传播得更远，并且随温度、氧气和底物发生可预测的变化，它们为了解地下微生物生物动力学提供了一个窗口——尤其是在动态融化条件下。

方法与材料

研究地点是阿拉斯加Goldstream Valley的Big Trail Lake (BTL)，这是一个因 abrupt permafrost thaw 在1949年至1967年间形成的年轻热喀斯特湖。该湖下方是一个延伸至约10–15米的talik，表明广泛的多年冻土退化。BTL的特点是排放高¹⁴C耗尽的CH₄，是 abrupt permafrost thaw 的证据，使其成为观察动态CH₄循环的理想热点。

沉积物岩心样品在2023年3月从BTL获取。进行了CH₄排放调查，并使用手持光学光谱仪测量了湖岸边界周围的CH₄摩尔分数。样品被运送到科罗拉多大学北极与高山研究所（INSTAAR）进行实验室培养。

进行了两个控制培养实验。第一个实验侧重于表征挥发性有机化合物（VOCs），靶向广泛的微生物代谢物，以评估与产甲烷活动潜在相关的非甲烷地球化学信号。第二个实验测量了温度梯度下的CH₄通量，随后进行了CH₄的碳同位素组成（δ¹³C-CH₄）分析。对来自两个培养的样品进行了鸟枪法宏基因组测序，以评估微生物群落组成和功能潜力作为温度和土壤深度的函数。

从BTL岩心的50厘米、200厘米和400厘米深度提取了核心子样品。在每个深度，收集了三个重复样品。土壤培养小瓶包含用于捕获VOCs的薄膜固相微萃取（TF-SPME）装置。样品小瓶在不同的温度下培养总共23天，期间间歇性地进行VOC和微生物采样。样品首先在5°C下保持7天，然后在12°C下保持接下来的8天，最后在-4°C下保持最后的8天。这些培养温度近似于多年冻土土壤在春季至夏末期间预期的融化和再冻结条件范围，捕捉了具有代表性的热梯度下的功能变化。

VOC使用TF-SPME在厌氧生物反应器中被动收集。TF-SPME的收获和更换在厌氧室中进行，以防止暴露于氧气和污染性VOCs。收集的TF-SPME被储存起来直到进行GCxGC-TOFMS分析。

还对一种产甲烷菌物种进行了VOC收集和分析，以寻找纯培养产甲烷菌和土壤样品VOC特征之间的重叠。使用了_iMethanosarcina acetivorans_i菌株C2A的培养物。在厌氧室中，使用无菌塑料吸管插入样品中提取约0.5克土壤用于微生物群落测序。微量离心管在测序前储存在-20°C。

对于鸟枪法宏基因组学，使用商业试剂盒提取DNA。提取的基因组DNA进行鸟枪法宏基因组测序。使用Illumina DNA Prep Kit制备测序文库。所有文库进行量化并合并到等量 abundance。最终的合并库使用qPCR进行量化。所有宏基因组文库在Illumina NovaSeq X平台上进行测序（2 × 150 bp paired-end configuration）。

原始序列读数使用Trimmomatic-0.33进行修剪以去除低质量特征；使用6 bp窗口大小和质量截止值20进行滑动窗口质量修剪，并且移除大小低于70 bp的读数。使用Kraken2移除宿主来源的读数，并使用sdust检测和移除低多样性读数。使用DIAMOND序列比对器对NCBI参考数据库进行抗菌素抗性性和毒力因子的遗传鉴定。使用GTDB物种代表性数据库（RS207）鉴定细菌和古菌。使用Sourmash分析微生物组成，并使用同样由Sourmash提供的GenBank数据库鉴定病毒、原生动物和真菌。使用BWA-MEM将读数映射回由Sourmash识别的基因组，并根据映射读数的计数确定微生物丰度。

VOC样品使用Gerstel热脱附单元（TDU）进行热脱附，该单元集成到LECO Pegasus BT4D comprehensive two-dimensional gas chromatograph with time-of-flight mass spectrometer (GCxGC-TOFMS)系统中。脱附的样品在Gerstel CIS 4低温进样口上重新聚焦，然后注入GCxGC-TOFMS。

使用ChromaTOF TILE软件（v1.2.6）对命中列表中的代谢物进行自上而下的定量分析。使用自定义脚本，将包含未识别和已识别VOCs的BTL的TILE特征表通过ClassyFire（一种用于化学品分类学分类的自动化工具）进行进一步处理。

为了模拟多年冻土融化过程中的地下CH₄动力学，使用了PFLOTRAN反应性传输模拟器，并增强了最初为海洋系统开发的HYDRATE模式。CH₄被视为顺序耦合流动和反应传输模型中的痕量气体，该模型求解能量、水和空气组分的守恒方程。质量和能量平衡考虑了相相互作用、扩散、达西流、传热和相变。使用温度依赖的Monod动力学对微生物过程——包括有氧呼吸、厌氧产甲烷作用和CH₄氧化——进行建模。使用Dual Arrhenius Michaelis–Menten Greenhouse Gas (DAMM-GHG)框架进一步改进了这些模拟，以捕捉温度敏感的微生物竞争和抑制效应。

结果

对Big Trail Lake (BTL)湖岸边界及相邻北部 feeder pond 的2023年3月调查观察到了升高的CH₄排放。在地面以上10厘米处CH₄摩尔分数高达12 ppm（背景值约2 ppm），整个站点存在空间异质性的通量。

为了评估随深度和温度的微生物群落动态，我们在厌氧微生物反应器中培养了BTL土壤核心子样品。培养温度从冻结条件逐步提高到5°C、12°C，最后到-4°C，每周一个间隔。在每个间隔进行宏基因组测序，同时进行GC × GC–MS分析挥发性有机化合物（VOC）谱。所有重复样品最初表现出相似的alpha和beta多样性，除了来自400厘米样品的重复3，这与其较低的alpha多样性一致。微生物组成在温度从-20°C升高到5°C后发生转变，在12°C时稳定下来，并在-4°C时观察到一些群落重组。在50厘米深度，_iArthrobacter_i占主导地位，其次是_iPseudomonas_i、_iMassilia_i和_iCaulobacter_i。更深的样品（>50厘米）显示出向兼性和专性厌氧菌的预期转变。例如，_iBradyrhizobium_i（兼性厌氧菌）在200厘米处更为普遍，而_iArthrobacter_i（专性好氧菌）减少。400厘米的样品显示出最高的微生物多样性，在-4°C下_iCandidatus Nitrotoga_i显著富集——表明在较冷条件下活跃的氮循环。_iMethanosarcina_i，一种关键的产甲烷古菌，在各个深度都有发现，但对温度表现出差异响应。在50厘米深度，其丰度在5°C培养后从2.8%下降到0.4%。在200厘米深度，它在5°C时略有增加，然后在12°C时急剧下降，但在-4°C时又上升到2%。在400厘米深度，_iMethanosarcina_i丰度最初较高（约2%），但随着变暖迅速下降，即使在-4°C时也保持较低水平。更深的土壤含有支持产甲烷作用的互养群落，包括_iCandidatus Nitrotoga_i、_iBradyrhizobium_i、_iPhenylobacterium_i和_iLimosilactobacillus_i。基因丰度的堆叠条形图证实_iMethanosarcina_i是最丰富的CH₄循环分类单元，尤其是在200厘米深度。甲烷氧化菌的相对丰度也增加了，特别是在200和400厘米的土壤中，在5°C培养后，甲烷氧化菌的多样性随着时间的推移而增加。

主成分分析（PCA）揭示了基于沉积物深度和培养温度的微生物群落的清晰分离。前两个主成分占据了数据集中方差的很大一部分，样品明显按深度（50厘米、200厘米和400厘米）聚类，并进一步按温度处理（-20°C至12°C）分层。在较高温度下培养的浅层样品往往与更深或更冷的样品分开分组，表明环境变量都强烈影响群落组成。

厌氧培养来自50厘米、200厘米和400厘米深度的沉积物样品揭示了跨步进温度 regime 的产甲烷和甲烷氧化分类群的明显变化。样品依次在0°C、5°C、12°C和-4°C下培养，每个温度一周。在50厘米深度，_iMethanobacterium_i和_iMethanosarcina_i是在0°C和5°C下的主要产甲烷菌，表明适应寒冷、近地表条件。在12°C观察到_iMethanosaeta_i和_iMethanoregula_i的显著增加，表明这些分类群对适度变暖反应更积极。冷却到-4°C后，产甲烷菌的整体丰度下降，尽管_iMethanobacterium_i仍然可检测到，表明具有一定的耐寒性。在200厘米深度，产甲烷菌多样性随温度增加而增加。_iMethanoculleus_i和_iMethanoregula_i在12°C特别富集，但在0°C丰度较低，在-4°C几乎不存在。这些模式表明在中层深度下，产甲烷菌在变暖条件下的代谢激活更强。在400厘米深度，产甲烷菌群落在12°C显示出最大的丰富度，_iMethanoculleus_i、_iMethanobacterium_i和_iMethanosarcina_i作为主要分类群。这些类群持续存在，尽管在返回-4°C时丰度减少，表明在深度处存在代谢更灵活或更具恢复力的产甲烷菌群落。

甲烷氧化菌在50厘米深度最丰富，并且主要在较低温度下活跃。I型甲烷氧化菌，包括_iMethylobacter_i和_iMethylomonas_i，在0°C和5°C时富集，但到12°C时急剧下降。在-4°C时，甲烷氧化菌分类群几乎检测不到。II型甲烷氧化菌（_iMethylocystis_i）在200厘米深度零星观察到，在5°C时存在峰值；然而，它们在其他温度下没有持续存在。在400厘米深度，甲烷氧化菌在所有温度处理中基本上不存在，表明CH₄氧化活性在更深的厌氧沉积物中受限。

产甲烷菌分类群的多样性和丰度随深度和温度增加而增加，在12°C时达到峰值，特别是在200厘米和400厘米的沉积物中。相比之下，甲烷氧化菌局限于浅层沉积物，并偏爱较低温度，在50厘米层中，0°C和5°C时丰度达到峰值。冷却到-4°C导致产甲烷菌和甲烷氧化菌丰度普遍下降，尽管几种产甲烷菌分类群持续存在，特别是在更深的样品中。这些结果表明了一个分层且对温度响应的群落，更深层的沉积物在变暖条件下有利于产甲烷活动，而浅层沉积物在寒冷、厌氧条件下支持CH₄氧化。

在60天的培养中，跨温度处理追踪了甲烷和CO₂的产生。甲烷积累（对数尺度）在10°C时最高，而在-4°C的排放在第22天和第60天之间趋于稳定。根据CH₄质量计算的CH₄通量与温度呈强正相关，而CO₂排放跨处理变化较小。最初7天的短暂CO₂峰值归因于残留氧气，到第15天减弱，此后CO₂产量稳步增加——除了在-4°C和-30°C处理中。

使用Q₁₀系数量化了CH₄生产的温度敏感性。Q₁₀值在第7天和第15天约为5，但到第22天上升到14，表明微生物对温度的响应随着时间的推移而加强。所有时间点的平均Q₁₀为7.9，远高于许多北方湿地模型中使用的值。碳同位素测量支持了这些发现。土壤有机质的δ¹³C值与C₃植被一致（-25.60 ± 0.70‰）。60天后，甲烷δ¹³C值从-4°C的-64.6‰到10°C的-38.9‰，显示出对温度的高度线性响应（R² = 0.997）。由于产量低，在-30°C处理中第60天未检测到甲烷。

宏基因组谱揭示了关键微生物群相对丰度的温度依赖性变化，这些微生物群在发酵、金属还原、产甲烷作用和CH₄氧化中具有功能作用，表明跨热 regime 代谢潜力的可能转变。在60天中尺度培养结束点时，四个温度处理（-30°C、-4°C、4°C和10°C）下的群落组成反映了这些趋势，特定类群对热输入表现出不同的响应。厌氧发酵菌如_iClostridium_i在冷冻条件下（-30°C时为2.8%）高度丰富，但随着变暖显著下降。其他充分表征的发酵菌如_iBacteroides_i在处理中持续存在，并可能在维持厌氧碳周转中发挥核心作用。相比之下，丰度较低的分类群如_iCitrifermentans_i和_iPaludibacter_i在4°C时表现出增加（分别为0.98%和0.23%）。尽管这些类群相对丰度较低，但它们是功能特化的厌氧菌，已知有助于有机物的发酵降解。它们在适度变暖时增加的代表性表明发酵群落组成的转变，并突出了功能响应但数量上次要的分类群的潜在生态相关性。金属还原菌（例如，_iGeobacter_i、_iGeomonas_i和_iGeotalea_i）也在4°C时富集，_iGeomonas_i达到2.23%，_iGeobacter_i在0.80%达到峰值（ANOVA, p < 0.01），表明支持下游互养产甲烷作用的异化金属还原途径的刺激。

产甲烷古菌也表现出温度依赖性的转变。_iMethanosarcina_i丰度从-30°C的0.44%增加到10°C的1.27%（ANOVA, p < 0.05），而更特化的分类群如_iMethanoregula_i和_iMethanothrix_i下降。同时，甲烷氧化菌样种群如_iRhodoferax_i和_iPolaromonas_i也对变暖表现出强烈响应。_iRhodoferax_i在4°C时达到峰值6.45%，而_iPolaromonas_i（通常被认为是耐寒的）随温度从0.15%稳步上升到0.64%，进一步促进了在较暖条件下潜在的CH₄氧化能力。重要的是，在宏基因组数据中检测到两个关键的CH₄氧化基因——_ixoxF_i和_immoX_i——具有明显的温度相关趋势（分别在补充表2中的R01146和R01142）。这两个基因在4°C和10°C时都富集，表明在变暖条件下CH₄和甲醇氧化遗传潜力增加。

用这些CH₄氧化基因注释的contigs在分类学上与非经典但日益丰富的微生物属相关联，包括_iAmycolatopsis_i、_iGeobacter_i、_iCitrifermentans_i和_iGeomonas_i。这些属不仅丰度随温度增加而增加，而且还携带与CH₄氧化相关的功能标记（_ixoxF_i、_immoX_i），强化了CH₄氧化潜力随温度增加而增加的观点，并且涉及比经典好氧甲烷氧化菌更广泛的系统发育范围。

我们量化了与厌氧甲烷氧化古菌（ANMEs）相关的功能标记基因的相对丰度，包括多血红素c型细胞色素（例如，_imtrA–H_i、_iomcX_i、_iomcI_i）、氢化酶复合物（_iechA–F_i）、甲酸脱氢酶（_ifdhA–F_i）和Rnf复合物基因（_irnfA–H_i）。跨四个温度条件（-30°C、-4°C、4°C、10°C），这些基因中的大多数表现出明显的温度依赖性模式。_imtrC_i、_iomcI_i、_iechA_i、_ifdhA_i、_ifdhD_i和_irnfC_i的基因计数在4°C时 consistently 最高，几个基因相对于更冷或更暖的处理显示出多倍增加。例如，_ifdhA_i从-30°C的27次命中增加到4°C的114次，然后在10°C下降到60次。类似地，_imtrC_i从-30°C的8次上升到4°C的31次。总共有超过30个ANME相关基因在4°C时丰度达到峰值，而更少的基因在-30°C或10°C时显示出最大计数。

我们在所有培养样品中检测到2846种独特的VOCs。尽管所有样品都产生VOCs，但它们的表达模式因温度和深度而异。在12°C培养的样品在所有深度表现出最多的高度表达的VOCs。出乎意料的是，-4°C时的VOC丰度在某些情况下（例如，50和400厘米）超过了5°C时的丰度，表明非线性的温度依赖性。VOC谱的层次聚类揭示了 consistent 的温度驱动分组。在200厘米深度，跨温度处理鉴定出2418种独特的VOCs。化合物类别的组成转变——特别是在5°C和-4°C之间——是明显的。有机盐在12°C占主导地位，有机金属化合物、有机氧化合物、脂质、碳氢化合物和苯环型化合物也很丰富。

热图比较揭示了跨多年冻土土壤剖面的VOC表达的清晰深度和温度依赖性模式。在50厘米深度，融化处理（5°C和12°C）显示出特定VOC特征的显著富集，几种化合物在12°C时显示出 elevated 的生产和释放，表明在更活跃的表层 during warming 存在强烈的微生物或化学活动。再冻结（-4°C）后，这些化合物的一个子集仍然保持 elevated，表明遗留效应或持续存在的挥发性生产，即使在寒冷条件下。在200厘米深度，12°C时的VOC表达也显示出中等程度的富集，尽管信号不如50厘米深度明显，可能反映了在更深、生物活性较低的土壤层中较慢的代谢响应。值得注意的是，一些VOCs只有在再冻结后才变得更加突出，表明可能的化学转化或应激诱导的释放。400厘米层整体表现出相对较低的VOC多样性和强度，对变暖的响应有限。然而，几种化合物在-4°C条件下 specifically 增加，表明冷冻活性过程或由快速冻结触发的潜在代谢转变。值得考虑的是，在该深度观察到的低VOC丰度是反映了本质上活性较低的微生物群落，还是仅仅反映了这些实验中应用的变暖持续时间有限。随着持续变暖，更深的群落可能有潜力随着时间的推移增殖并增加VOC生产，导致组成变化。总体而言，数据表明温度变化强烈影响VOC动力学，特别是在较浅的土壤中。这些挥发性特征可能作为生物地球化学再活化和多年冻土融化中微生物群落转变的早期指标，对预测CH₄通量和监测受多年冻土影响的生态系统具有潜在意义。

VOCs的化学分类揭示了跨温度处理和土壤深度的 distinct 模式，反映了代谢物生产中的热敏感性和微生物来源特异性。化学超类的分布突出了融化多年冻土环境中微生物代谢和应激响应的功能分层。

在200厘米和12°C时，VOC谱富含有机金属化合物、苯环型化合物、有机氧化合物和碳氢化合物。脂质和类脂分子，以及有机杂环化合物，也很丰富。这种化学多样性的谱与活跃的产甲烷代谢和次级代谢物生产一致，表明有机金属VOCs作为古菌代谢活动的潜在生物标志物。在5°C时，200厘米的VOC谱转向一个多样性较少的集合，以有机盐和有机金属化合物为主，表明减少但持续的微生物代谢。在-4°C时，发生了进一步的转变，有机氮化合物和苯环型化合物变得突出。这些变化表明应激诱导代谢物的出现，可能与冷冻保存机制或缓慢的合成代谢有关。VOC多样性在表层土壤培养中最高。在12°C时，50厘米的谱也以有机盐、苯环型化合物和有机金属化合物为主，同时有机氮和氧化合物也有 substantial 贡献。这些特征表明广泛的微生物激活。在5°C和50厘米深度，脂质和类脂分子是主导类别，其次是有机氧化合物和苯环型化合物，指向中等冷应激下的膜周转和生物合成。在-4°C再冻结使VOC谱再次转变，有机氮化合物和有机盐变得最丰富。值得注意的是，苯丙素类和聚酮化合物 uniquely 出现在这种条件下，暗示在微生物应激防御或信号传导中的潜在作用。在更深的400厘米样品中，整体VOC多样性较低。在-4°C和400厘米深度，碳氢化合物和