压力下的β细胞通过上调MMP-3促进1型糖尿病胰岛周围细胞外基质降解

本研究发现，在1型糖尿病（T1D）发展过程中，处于炎症和高糖压力下的β细胞会显著上调基质金属蛋白酶-3（MMP-3）的表达，直接导致IV型胶原（COL IV）的降解，破坏胰岛周围细胞外基质（ECM）屏障。这一发现揭示了β细胞在T1D pathogenesis中主动参与微环境重塑的新机制，为通过抑制MMP-3保护胰岛功能提供了潜在治疗策略。

　　

引言

1型糖尿病（T1D）是一种自身免疫性疾病，其特征是免疫介导的胰腺胰岛中胰岛素生成β细胞的破坏。胰岛周围的细胞外基质（ECM）是一个复杂的蛋白质屏障，在T1D中会部分由于浸润的免疫细胞而丢失。在T1D期间，压力下的β细胞对ECM降解的贡献仍不清楚。

胰岛周围的ECM为胰腺胰岛提供结构和生化支持，维持细胞功能和稳态。胰岛被两种特殊形式的ECM包围：直接在胰岛周围形成胶囊的基底膜（BM）和围绕胰岛周围BM、主要导管和动脉连接外分泌和内分泌区室的间质基质（IM）。BM主要由层粘连蛋白-10、IV型胶原（COL IV）、纤连蛋白组成，而IM由纤维状胶原和高硫酸化蛋白聚糖组成。BM和IM共同提供促进胰岛活力和功能的生化和机械信号。

T1D通过定义的阶段进展，从出现胰岛定向自身抗体（阶段1）开始，随后由于胰岛素分泌受损导致血糖异常（阶段2），最终临床诊断（阶段3），此时60%–90%的β细胞质量已经丢失。虽然免疫介导的对β细胞的攻击在T1D的背景下已被广泛研究，但新出现的证据表明，胰岛周围ECM的丢失在疾病发作和进展中起着关键作用。ECM的降解由蛋白水解酶介导，如基质金属蛋白酶（MMPs）、具有血小板反应蛋白基序的去整合素和金属蛋白酶（ADAMTS）蛋白酶和乙酰肝素酶。这些酶通过降解结构ECM成分，如胰岛周围BM中的COL IV和层粘连蛋白-10，在组织修复和疾病进展中起关键作用，这允许免疫浸润和T1D的进展。

尽管在NOD小鼠和具有T1D 2+自身抗体的人类供体中，胰岛周围ECM的变化已得到很好的表征，但这些变化如何促进T1D发病机制，特别是从T1D阶段1到阶段3β细胞死亡的急剧增加，仍然知之甚少。此外，在胰岛浸润期间，T细胞和巨噬细胞产生高水平的促炎细胞因子，包括干扰素-α（IFN-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和干扰素-γ（IFN-γ），导致胰岛应激、功能障碍和死亡。细胞因子诱导的细胞应激在许多细胞类型中引起组织降解蛋白酶的上调，但细胞因子诱导的β细胞ECM降解尚未被探索。

目前尚不清楚β细胞是否在T1D中降解胰岛周围ECM，以及它们是否促进其ECM的降解。本研究旨在调查T1D发病过程中ECM丢失的时间方面以及压力下β细胞在主动降解其ECM中的作用。我们研究的重点是MMP-3，一种广泛的底物stromelysin-1，可降解COL IV，并且已知可激活其他MMP，从而在炎症条件下放大ECM重塑。

结果

促炎细胞因子和高血糖导致小鼠和人类胰岛中ECM降解酶MMP-3的上调

为了理解T1D中的细胞因子应激如何影响胰岛功能，我们使用qPCR分析了MMP-3的基因表达，这是一种降解COL IV的广泛底物stromelysin。用和不用于0.1X促炎细胞因子混合物（1ng/ml TNF-α, 0.5ng/ml IL-1β, 10ng/ml IFN-γ）处理小鼠和人类胰岛长达72小时。在细胞因子处理的小鼠胰岛中，与对照相比，MMP-3基因表达在48小时和72小时分别增加了23.92 ± 3.85和33.04 ± 6.89倍。在细胞因子处理的人类胰岛中，与对照相比，MMP-3基因表达在48小时和72小时分别增加了167.7 ± 45.08和208.7 ± 23.66倍。这些发现支持促炎细胞因子应激上调小鼠和人类胰岛中的MMP-3基因表达。

为了进一步证明MMP-3表达在患有T1D的胰岛中升高，分离了12-15周龄血糖正常的NOD小鼠胰岛和年龄匹配的NOD-RAG1KO对照小鼠胰岛用于qPCR。我们的数据显示，与免疫缺陷的NOG-RAG对照相比，血糖正常的NOD小鼠中MMP-3基因表达增加了4.57 ± 1.99倍。

为了理解与T1D症状阶段相关的高血糖如何影响胰岛功能，将人类胰岛与过量的20mM葡萄糖培养长达72小时以诱导高血糖。葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）用于确定高血糖诱导的胰岛应激。在高血糖（HG）条件下，与未处理的对照相比，在2mM葡萄糖时胰岛素分泌增加，在20mM葡萄糖时胰岛素分泌减少，这表明GSIS功能障碍。我们还计算了刺激指数（SI），即20 mM与2 mM葡萄糖时胰岛素分泌的比率，以评估β细胞对葡萄糖的反应性。从对照组到HG组，SI在所有时间点都下降。具体来说，在72小时，HG条件下的SI显著低于72小时对照，这进一步证明了胰岛素分泌功能障碍。

接下来我们检查了这种应激如何影响MMP-3基因表达。qPCR数据显示，与对照相比，HG处理的胰岛中MMP-3基因表达在24小时和48小时分别增加了2.20 ± 0.31倍和2.25 ± 0.40倍。总之，qPCR数据支持细胞因子处理和高血糖在介导小鼠和人类胰岛中MMP-3上调中的作用。

我们接下来评估了MMP-3蛋白水平，以确认转录上调是否导致蛋白表达增加。如上所述，用和不用于0.1X促炎细胞因子混合物处理小鼠和人类胰岛长达72小时。在48和72小时，与未处理的对照相比，细胞因子处理的小鼠胰岛中MMP-3蛋白水平分别增加了1.48 ± 0.05和1.22 ± 0.04倍。在人类胰岛中发现了类似的结果，我们观察到在细胞因子处理和对照条件之间，MMP-3蛋白表达在48小时和72小时分别增加了1.02 ± 0.33和2.02 ± 0.86倍。当人类胰岛在高血糖条件下用过量的20mM葡萄糖处理时，在高血糖和对照条件之间，MMP-3蛋白表达在48小时和72小时分别增加了1.17 ± 0.17和1.25 ± 0.08倍。总之，这些数据支持促炎细胞因子应激和高血糖条件可以导致小鼠和人类胰岛中胰岛特异性的MMP-3蛋白表达。

高血糖诱导小鼠胰腺切片中MMP-3的表达和COL IV的降解

在确定应激胰岛在体外表达MMP-3在基因和蛋白水平后，我们接下来试图评估NOD小鼠中MMP-3的表达，该小鼠在12周龄后自发发展为T1D，并早在4周龄时就开始出现胰岛炎。我们使用免疫组织化学染色新鲜冷冻的胰腺切片，检查了12-15周龄血糖正常（NG）NOD小鼠、年龄匹配的高血糖（HG）NOD小鼠和年龄匹配的免疫缺陷NOD-Scid小鼠的胰腺切片中的MMP-3和COL IV。MMP-3和COL IV在后续切片中进行染色。胰岛外围密集的青色核染色种群与胰岛素染色结合用于分配胰岛炎评分。

12-15周血糖正常的NOD小鼠具有异质性的胰岛炎水平，无论是在单个动物内还是在动物之间。在NG NOD和HG NOD中，我们看到胰岛素阳性区域预期减少，免疫浸润增加，表明这些动物中T1D的发作。此外，与NOD-Scid对照相比，NG NOD和HG NOD切片中的胰岛有明显的MMP-3表达增加。我们还注意到与NOD-Scid对照相比，NG NOD和HG NOD中外分泌MMP-3表达增加；然而，胰岛的MMP3染色似乎比外分泌组织更强。

为了量化组织切片中MMP-3的变化，我们计算了总MMP-3染色为MMP-3荧光强度乘以染色面积，归一化到胰岛素阳性面积，发现与NOD-Scid对照相比，NG和HG NOD小鼠中MMP-3染色增加，其中HG NOD小鼠具有最高水平的β细胞特异性MMP-3表达。按胰岛炎评分对MMP-3水平进行分层显示，对于NG和HG NOD，β细胞MMP-3水平随着胰岛炎评分的增加而增加。然而，与NG NOD切片相比，HG NOD切片中的β细胞MMP-3水平始终较高，并且这种效应与胰岛炎评分无关。总之，我们的数据表明，胰岛素产生β细胞中MMP-3的表达是由糖尿病前期NOD小鼠中的胰岛炎和更大程度的高血糖应激驱动的。

与MMP-3染色相反，我们看到与NOD-Scid对照相比，NG NOD和HG NOD切片中COL IV染色减少，其中高免疫浸润区域缺乏COL IV染色。具体来说，在HG NOD中，胰岛素阳性胰岛区域以及浸润的胰岛外围的COL IV减少。NG和HG NOD小鼠血管内的COL IV似乎完整；然而，染色强度降低，表明与NOD-Scid对照相比，围绕血管的BM较少。

我们接下来将COL IV染色量化为总COL IV阳性面积归一化到总胰岛面积，包括任何免疫浸润物。我们发现与NOD-Scid对照相比，NG NOD切片中COL IV染色面积归一化到总胰岛面积略有减少，并且HG NOD中COL IV染色显著减少。按胰岛炎评分进行分层进一步揭示了在血糖正常和高血糖条件下，从低（评分0–1）到高（评分3）浸润，COL IV染色面积逐渐下降。虽然在低胰岛炎评分（0–1）时COL IV面积没有显著差异，可能是由于HG NOD切片中具有此评分的胰岛数量较少，但在具有高胰岛炎评分（2–3）的胰岛中，具有相同胰岛炎评分的HG NOD切片的COL IV显著少于NG NOD小鼠。与MMP-3结果一起，这支持高血糖应激上调β细胞MMP-3表达，导致胰岛周围COL IV的丢失，这与胰岛炎无关。

高血糖诱导人类胰腺切片中MMP-3的表达和COL IV的降解

为了确定人类胰岛是否也能够在T1D中重塑ECM，对来自健康、两个或更多自身抗体阳性（Aab+）和近期发病（<6个月）T1D供体的人类胰腺切片进行MMP-3和COL IV染色，以确定MMP-3表达和COL IV降解的类似趋势是否在物种间保守。人类供体在年龄、性别和BMI方面尽可能匹配。T1D供体在诊断后六个月内，并且基于HbA1c水平≥10可能患有高血糖。nPOD病理分析证实了请求切片的Aab+和T1D供体组织块中存在胰岛炎。

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