比较蛋白质组学揭示FB1与HFB1在猪肠上皮细胞中的差异毒性机制及致癌通路调控

本研究针对伏马毒素B1(FB1)及其水解产物HFB1的毒性差异机制不明确的问题，通过蛋白质组学技术分析猪肠上皮细胞IPEC-J2的分子响应。研究发现HFB1引起更广泛的蛋白表达变化，通过调控纤维连接蛋白1(FN1)、铁代谢蛋白(FTL/FTH1)和细胞外基质相关蛋白(SPARC/SDC4)等靶点，激活PI3K-Akt等癌症相关通路。该研究为阐明两种毒素的毒性机制提供了分子证据，对饲料安全评估和人类健康保护具有重要意义。

　　

在食品安全与动物健康领域，伏马毒素B₁(Fumonisin B₁, FB₁)作为一种由镰刀菌产生的霉菌毒素，长期困扰着畜牧业和人类健康。这种毒素通过抑制神经酰胺合成酶，扰乱鞘脂代谢，导致多种哺乳动物发生中毒症状，尤其是猪群表现为肝毒性、肾毒性和肠道屏障功能损伤。更令人担忧的是，FB₁被国际癌症研究机构列为可能致癌物，其在食品和饲料中的污染成为全球性问题。

为了降低FB₁的毒性，科学家们开发了酶水解技术将其转化为水解伏马毒素B₁(Hydrolysed Fumonisin B₁, HFB₁)。理论上，HFB₁对神经酰胺合成酶的抑制能力显著降低，被认为是一种更安全的替代物。然而令人困惑的是，尽管体内实验显示HFB₁毒性较低，但在某些体外实验中却表现出比FB₁更强的细胞毒性。这种矛盾结果使得科学界对HFB₁的安全性评估产生分歧，其分子机制更是迷雾重重。

针对这一科学难题，由Nabeela Gamiet领衔的研究团队在《Mycotoxin Research》上发表了创新性研究成果。研究团队利用猪肠上皮细胞系IPEC-J2这一理想的肠道屏障模型，通过多组学技术深入解析了FB₁和HFB₁的毒性作用机制。他们的工作不仅揭示了两种毒素在蛋白质表达层面的显著差异，还发现了可能与癌症发展相关的关键通路，为食品安全风险评估提供了重要的分子依据。

研究采用了多种关键技术方法：首先通过细胞活力检测(ATP测定)、细胞凋亡(Caspase-3/7活性)和增殖试验(BrdU掺入法)评估毒性效应；随后使用白细胞介素-8(IL-8)ELISA试剂盒检测炎症反应；核心的蛋白质组学分析通过液相色谱-质谱联用技术(LC-MS/MS)进行，结合Gene Ontology和KEGG通路富集分析挖掘差异表达蛋白的生物学功能；最后利用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用网络。所有统计分析使用GraphPad Prism软件，采用ANOVA和Tukey-Kramer检验进行显著性分析。

细胞毒性评估揭示剂量和时间依赖性效应

研究人员首先建立了细胞优化模型，评估了FB₁和HFB₁在0.98-500μM浓度范围内处理6和24小时对IPEC-J2细胞的影响。结果显示，FB₁在500μM浓度下处理24小时未引起细胞活力的显著降低，而HFB₁在相同条件下使细胞活力下降至40%。特别值得注意的是，低浓度HFB₁(0.98-7.81μM)在6小时处理后反而刺激了细胞活力增加，这种现象可能与损伤相关分子模式(DAMPs)的释放有关。

在细胞凋亡方面，FB₁在125-500μM浓度范围内显著诱导caspase-3/7活性，而HFB₁在62.5-500μM浓度下引起更强烈的凋亡反应。细胞增殖实验表明，两种毒素在高浓度(>31.25μM)下均抑制细胞增殖，其中HFB₁的抑制效果更为显著。炎症因子IL-8的表达在FB₁处理组中降低，这与细胞活力下降的趋势一致。

蛋白质组学分析揭示差异表达蛋白谱

基于细胞毒性结果，研究人员选择了7.81μM和15.63μM这两个亚细胞毒性浓度进行深入的蛋白质组学分析。通过LC-MS/MS技术，他们共鉴定出52个差异表达蛋白(Differentially Abundant Proteins, DAPs)，满足fold change≥1.3或≤0.7且BH调整p值<0.1的标准。

HFB₁处理引起了更广泛的蛋白表达变化：7.81μM HFB₁处理组有40个DAPs(15个上调和25个下调)，15.63μM HFB₁处理组有18个DAPs(3个上调和15个下调)。相比之下，15.63μM FB₁仅引起5个DAPs(全部上调)，而7.81μM FB₁未引起显著变化。

Venn图分析显示，纤维连接蛋白1(Fibronectin 1, FN1)是唯一一个在三种处理条件下均发生变化的蛋白。值得注意的是，FB₁上调FN1表达，而HFB₁下调其表达，这种相反调控模式暗示了两种毒素可能通过不同机制影响肠道功能。

功能富集分析揭示通路水平差异

通过Gene Ontology分析发现，HFB₁处理显著影响高尔基体功能、核糖体过程和ERK1/ERK2信号通路的负调控等生物学过程。上调的蛋白主要富集在细胞外基质(Extracellular Matrix, ECM)结合、蛋白复合物结合和上皮分支形态发生等功能类别。

KEGG通路富集分析显示，FB₁处理显著富集ECM-受体相互作用、癌症中的蛋白聚糖和AGE-RAGE信号通路等功能类别。HFB₁处理则影响PI3K-Akt信号通路、粘着斑和吞噬体等通路。特别值得注意的是，7.81μM HFB₁处理特异性地富集了核糖体和癌症相关的ECM-受体相互作用通路。

蛋白质-蛋白质相互作用网络分析

通过STRING数据库构建的蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-Protein Interaction, PPI)网络提供了更深层次的机制洞察。

在FB₁处理组中，FN1与多种整合素亚基(ITGA5、ITGAV、ITGB1、ITGB3)存在强烈的预测相互作用，这些相互作用与整合素-FN1信号通路相关，该通路在肿瘤进展中发挥关键作用。

在HFB₁处理组中，下调的FN1与多种 syndecan(SDC1、SDC2、SDC4)和胶原蛋白(COL1A1)通路相互作用。这些蛋白与癌症中的蛋白聚糖和ECM-受体相互作用通路相关。

高浓度HFB₁(15.63μM)处理同时影响整合素和syndecan通路，导致更广泛的癌症促进效应。网络分析显示FN1与整合素(ITGA5、ITGB1)、syndecans(SDC4)、fibulin(FBLN2)和层粘连蛋白亚基γ1(LAMC1)相互作用，这些相互作用富集到PI3K-Akt信号通路、伤口愈合和其他癌症相关通路。

关键靶点分子的功能解析

研究发现多个关键蛋白在两种毒素处理下发生显著变化。CD276(B7-H3)作为一种免疫检查点分子，在FB₁处理下上调，而在HFB₁处理下下调，表明两种毒素可能通过不同机制影响免疫调节。

铁代谢相关蛋白 ferritin light chain(FTL)和 ferritin heavy chain(FTH1)在HFB₁处理下上调，表明铁稳态改变，这可能增加氧化应激并创造肿瘤促进环境。Netrin-4(NTN4)和ST14(一种丝氨酸蛋白酶)的下调暗示HFB₁可能影响上皮完整性和调节通路。

细胞外基质蛋白SPARC(一种基质细胞蛋白)在HFB₁处理下下调，反映了细胞外基质动力学的破坏。TINAGL1、FBLN2和SDC4的表达降低表明HFB₁可能干扰血管生成和伤口愈合通路。

研究结论与重要意义

本研究通过综合应用细胞生物学和蛋白质组学方法，系统比较了FB₁和HFB₁对猪肠上皮细胞的毒性效应和分子机制。研究发现HFB₁在体外条件下引起比FB₁更广泛的蛋白质表达变化，这与其更显著的细胞毒性效应相一致。

从机制角度看，FB₁主要通过上调FN1和激活整合素相关通路发挥毒性作用，这些通路与癌症进展、血管生成和细胞迁移密切相关。而HFB₁则通过更复杂的作用机制，影响syndecan和胶原蛋白通路，破坏细胞外基质动力学，干扰铁代谢平衡，并激活PI3K-Akt等关键信号通路。

这些发现对于理解和评估HFB₁的安全性具有重要启示。虽然体内研究普遍认为HFB₁毒性较低，但本研究的体外实验结果表明，在某些条件下HFB₁可能通过激活多种癌症相关通路产生潜在风险。这种体内外差异可能源于体内代谢转化、系统因素或肠道微生物群的调节作用，提示我们需要更复杂的研究模型来全面评估HFB₁的安全性。

从应用视角看，本研究为饲料安全生产和霉菌毒素防控提供了重要的分子标志物和机制见解。FN1、CD276、FTL/FTH1等关键靶点的发现，为开发快速检测方法和干预策略提供了理论依据。同时，研究建立的蛋白质组学分析平台和细胞模型也为未来评估其他霉菌毒素的毒性机制提供了可靠的技术路径。

最后，本研究强调了在食品安全风险评估中考虑多种分子通路和细胞过程的重要性。单一的毒性终点评估可能无法全面捕捉化合物的潜在风险，整合多组学技术的系统毒理学方法将为更准确、更全面的安全性评估提供强有力的科学支持。