利用Tip100转座子系统实现青鳉鱼高效转基因：一种新型遗传操作工具的开发与验证

本刊推荐：为解决青鳉鱼（Oryzias latipes）转基因过程中Tol2系统因内源性转座活性导致转基因不稳定的问题，研究人员开展了基于植物源Tip100转座子的转基因系统优化研究。结果表明，Tip100介导的转基因在体细胞和生殖系均呈现高效整合（生殖系传递率62.7%），且截短识别序列（100 bp）后仍保持活性。该研究为鱼类遗传操作提供了稳定高效的新工具（Transgenic Res. 2025;34:46）。

　　

在模式生物研究领域，小型鱼类因其繁殖周期短、胚胎透明等特点成为脊椎动物遗传学研究的重要载体。其中日本青鳉（Oryzias latipes）与斑马鱼（Danio rerio）并列为两大重要模型，但青鳉具有更丰富的野生品系资源、温度适应性强以及稳定的遗传性别决定机制等独特优势。然而，在转基因技术层面，青鳉研究长期面临一个特殊挑战：常用的Tol2转座子系统源于青鳉自身基因组，其内源性转座活性可能导致已整合的转基因发生二次移动，造成表达不稳定。虽然科学家尝试过Sleeping Beauty和玉米Ac/Ds等替代系统，但存在效率不稳定、质粒资源匮乏等问题。

在此背景下，研究人员将目光投向了一种植物源转座子系统——Tip100。该转座子最初在观赏植物圆叶牵牛（Ipomoea purpurea）的花色变异突变体中发现，属于hAT超家族转座子，与Tol2和Ac/Ds同属一个家族。Tip100在植物中已证实具有自主转座能力，但其在动物系统中的应用潜力尚未开发。考虑到hAT家族转座子在青鳉中的普遍高效性，研究团队假设Tip100系统可能在青鳉中介导高效稳定的转基因整合。

为验证这一假设，研究团队构建了包含Tip100识别序列的转基因载体pBS-Tip100-actb4k-EGFP，其中包含青鳉β-肌动蛋白（actb）启动子驱动的EGFP报告基因。通过显微共注射转座酶mRNA和转基因载体至青鳉单细胞期胚胎，他们观察到注射组中出现广泛EGFP表达的个体比例显著高于对照组（67.74% vs 19.11%）。通过 excision assay 检测到特异的164 bp条带，证实了Tip100介导的转座事件确实发生。

为进一步提高系统实用性，研究人员将原本2.2 kb的识别序列截短至仅保留两端的100 bp序列。令人惊喜的是，改造后的载体pBS-Tip100-LR100-actb4k-EGFP仍保持相似的转座效率（63.16% vs 7.61%），这大大降低了分子克隆的操作难度。

在生殖系传递效率评估中，研究团队采用了生殖细胞特异性表达载体pBS-Tip100-LR100-olvas-EGFP，该载体使用青鳉vasa（olvas）基因启动子驱动EGFP表达。结果显示，Tip100 mRNA共注射组的生殖系阳性个体比例显著提高（62.69% vs 20.97%）。更令人印象深刻的是，所有7只筛选到的Founder鱼均成功产生了EGFP阳性后代，生殖系传递率最高达58.06%，最低也有4.69%，表现出良好的稳定性。

通过反向PCR（inverse PCR）技术对三个转基因品系的插入位点进行分析，发现Tip100介导的转基因整合具有典型的hAT超家族特征：在插入位点产生8 bp的靶位点重复（target site duplication）。插入位置分布在不同的染色体上，其中两个位于基因内含子区，一个位于基因间区，提示Tip100可能具有一定的基因组位置偏好性。

本研究采用的关键技术方法包括：Tip100转posase表达载体的构建与mRNA体外转录、转基因载体设计与优化（包含全长和截短识别序列版本）、青鳉胚胎显微注射技术、体细胞和生殖系表达效率的荧光显微镜评估、excision assay检测转座事件、生殖系传递率统计分析、以及通过inverse PCR和Sanger测序鉴定基因组插入位点和特征。实验使用的青鳉himedaka品系（MT835）来自国家生物资源计划（NBRP）青鳉资源中心。

研究结果表明，Tip100转座子系统在青鳉中表现出优异的转基因效率：体细胞表达方面，共注射转posase mRNA可显著提高广泛表达个体的比例；系统优化方面，仅需100 bp识别序列即可维持转座活性；生殖系传递方面，获得阳性Founder的比例高达62.7%，且所有Founder均能产生转基因后代；分子机制方面，整合事件呈现典型的hAT超家族特征（8-bp duplication），证实为转座子依赖性整合。

这些发现证实Tip100系统是一种高效、稳定的转基因工具，其识别序列短、操作简便、效率高的特点使其在青鳉及其他鱼类遗传操作中具有广阔应用前景。虽然仍需进一步评估其载体容量（cargo size capacity）和插入位点偏好性，但本研究无疑为鱼类遗传学研究提供了除Tol2、Sleeping Beauty和Ac/Ds之外的新选择，特别是解决了青鳉中因内源性Tol2活性导致的转基因不稳定问题。该研究成果发表于《Transgenic Research》期刊，为发育生物学、遗传学和基因组学研究提供了重要的技术支撑。