OsDUF846.2过表达增强水稻对盐和热胁迫敏感性的分子机制研究

本研究针对水稻盐胁迫和热胁迫耐受性机制，聚焦DUF846家族成员OsDUF846.2的功能解析。通过过表达株系构建、生理生化指标检测和转录组分析，发现OsDUF846.2过表达会降低抗氧化酶活性、破坏ROS平衡、抑制渗透调节物质积累，并通过调控细胞骨架稳定性、蛋白稳态维持和RNA代谢等通路，负向调节水稻对盐热胁迫的耐受性。该研究为作物抗逆育种提供了新靶点，丰富了DUF蛋白家族的功能认知。

　　

随着全球气候变化加剧，土壤盐渍化和高温胁迫已成为制约水稻生产的主要非生物胁迫因素。据统计，中度盐度(4-8 dS/m)可使主要作物减产50%以上，而全球平均气温每升高1℃会导致水稻平均减产3.2%。面对这些挑战，解析水稻应对非生物胁迫的分子机制已成为育种工作的重要方向。

在植物应对胁迫的复杂网络中，DUF(Domains of Unknown Function)蛋白家族因其含有结构保守但功能未知的结构域而备受关注。其中DUF846家族在真核生物中广泛分布，尤其在作物中高度保守。虽然研究表明该家族成员如ECHIDNA蛋白参与反式高尔基体网络(TGN)分选和分泌过程，但对其在非生物胁迫响应中的功能知之甚少。

在此背景下，Zhu等人在《BMC Plant Biology》上发表了关于水稻OsDUF846.2基因的最新研究成果。为了探究该基因的功能，研究团队综合运用了生物信息学分析、GUS组织化学染色、亚细胞定位、基因过表达株系构建、生理生化指标检测、转录组测序(RNA-seq)和实时定量PCR(qPCR)等技术方法。实验材料以日本晴(Nipponbare)为遗传背景，通过农杆菌介导的遗传转化获得转基因株系，所有测序数据分析均使用Majorbio云平台完成。

生物信息学分析与表达模式

研究人员首先对OsDUF846.2启动子区1500 bp序列进行分析，发现了多个与非生物胁迫相关的顺式作用元件，包括JA响应的CGTCA-motif、GA响应的GARE-motif、低温响应的LTR元件、干旱诱导的MYB元件和WRKY转录因子结合位点W-box。系统进化分析显示DUF846家族成员在稻属植物中具有高度序列保守性。

通过GUS染色发现OsDUF846.2在茎、叶、叶鞘、叶舌、节间、颖壳和花药等多种组织中均有表达，其中在穗部表达量最高。值得注意的是，在20% PEG、180 mmol/L NaCl、42℃和4℃处理下，根部GUS染色明显加深，表明该基因能够响应多种非生物胁迫。亚细胞定位实验证实OsDUF846.2-GFP融合蛋白与内质网标记蛋白共定位，说明该蛋白定位于内质网。

OsDUF846.2过降低水稻盐胁迫耐受性

研究人员构建了OsDUF846.2过表达株系，在120 mmol/L NaCl处理下，过表达株系的发芽率和幼苗高度显著低于野生型(WT)。在180 mmol/L NaCl胁迫4天后，过表达株系表现出更严重的萎蔫现象，存活率显著降低。

在生理水平上，盐胁迫后过表达株系的Evans blue染色更深，丙二醛(MDA)含量和相对电解质泄漏率显著升高，表明细胞膜受损更严重。同时，过表达株系的脯氨酸和可溶性糖含量显著低于WT，说明渗透调节能力受损。

在氧化应激方面，NBT和DAB染色显示过表达株系积累了更多的超氧阴离子(O₂^-)和过氧化氢(H₂O₂)，而超氧化物歧化酶(SOD)活性显著降低，表明活性氧(ROS)清除能力下降。

OsDUF846.2过降低水稻热胁迫耐受性

在38℃中度热胁迫下，过表达株系的幼苗生长受到更明显抑制。在45℃严重热胁迫33小时后，过表达株系表现出更严重的萎蔫和损伤，存活率显著降低。

生理检测显示，热胁迫后过表达株系的MDA含量和相对电解质泄漏率显著高于WT，细胞膜热稳定性降低。脯氨酸和可溶性糖含量也显著低于WT，渗透调节能力受损。ROS检测发现过表达株系积累了更多的O₂^-和H₂O₂，而SOD活性显著降低。

转录组分析揭示分子机制

通过RNA-seq分析，发现在正常条件下，过表达株系中有911个差异表达基因(DEGs)共同表达。GO功能注释显示这些基因主要富集在"胞外区"、"氧化还原酶活性"、"血红素结合"和"质外体"等类别。KEGG分析表明这些DEGs参与"二萜类生物合成"、"植物激素信号转导"和"淀粉蔗糖代谢"等通路。

在盐胁迫下，与WT相比，过表达株系中有568个基因上调和1756个基因下调。下调基因富集在"胞外区"、"质外体"、"聚合细胞骨架纤维"、"微管"和"氧化还原酶活性"等类别，涉及"苯丙烷生物合成"、"角质、木栓质和蜡质生物合成"、"二萜类生物合成"和"淀粉蔗糖代谢"等通路。qPCR验证发现细胞骨架相关基因OsTUB1、OsTUB6和抗氧化相关基因OsPRX38、OsGL1-6以及胁迫响应基因OsNHX1、OsLEA3、OsHKT1;4均下调表达。

在热胁迫下，过表达株系中有4546个基因上调和3122个基因下调。下调基因富集在"蛋白质折叠"、"RNA代谢过程"、"温度刺激响应"、"热响应"和"RNA加工"等类别，涉及"内质网蛋白质加工"、"真核生物核糖体生物发生"、"RNA聚合酶"和"核苷酸切除修复"等通路。qPCR验证发现热休克蛋白基因OsHSP17.0、OsHSP24.1、OsHSP74.8、Oshsp82A和RNA代谢基因OsXrn3均下调表达。

OsDUF846.2调节农艺性状和生长发育

在成熟期，过表达株系的株高、结实率、主穗长均显著低于WT，但有效分蘖数增加。籽粒长度、宽度和千粒重也均降低。外源GA₃处理能够恢复过表达株系的矮化表型，说明内源赤霉素(GA)含量缺陷可能是导致矮化的原因。qPCR分析发现GA生物合成基因OsGA20ox2下调表达，而GA失活基因OsGA2ox5、OsGA2ox6、OsGA2ox9上调表达。

本研究系统揭示了OsDUF846.2通过多途径负向调控水稻盐热胁迫耐受性的分子机制。在盐胁迫下，OsDUF846.2过表达通过抑制细胞骨架稳定性相关基因、抗氧化酶基因和渗透调节物质合成基因的表达，增强ROS积累和氧化损伤，降低细胞膜稳定性。在热胁迫下，该基因通过影响热休克蛋白表达、RNA代谢、DNA修复和抗氧化能力，破坏蛋白质稳态和细胞器功能。此外，OsDUF846.2还通过调节GA代谢影响植株生长发育。

这些发现不仅丰富了DUF蛋白家族的功能认知，为作物抗逆育种提供了新的分子靶点，而且对应对全球气候变化背景下作物安全生产具有重要理论意义和实践价值。研究人员建议未来研究应着重探究OsDUF846.2在盐胁迫下对细胞结构组分和次级代谢途径的具体调控机制，在热胁迫下对蛋白质稳态维持和RNA代谢的分子调控网络，以及内源GA缺陷对植物激素信号通路的影响，从而更深入理解OsDUF846.