青稞低温应答中LncRNA-mRNA调控网络解析：揭示抗寒新机制

本研究针对青藏高原青稞常遭低温胁迫影响产量的问题，通过RNA-seq分析两个品种在6个温度梯度下的转录组，发现25,809个LncRNAs和75,384个mRNAs。低温组（24℃/12℃/5℃）和冷冻组（0℃/-5℃/-8℃）分别鉴定出2,719和2,563个差异LncRNAs，通过cis/trans模式预测1,904对LncRNA-mRNA互作。GO/KEGG分析显示代谢过程、刺激响应及抗坏血酸代谢通路（ko00053）显著富集，筛选出HvWRKY71、HvbHLH112等关键转录因子。研究表明LncRNAs通过调控抗氧化途径增强青稞低温适应性，为抗寒育种提供新靶点。

　　

在青藏高原的严酷环境中，青稞（Hordeum vulgare L. var. nudum Hook.f.）作为当地人民的主要口粮和饲料来源，面临着低温这一重大自然挑战。随着全球气候剧烈变化，极端低温天气频繁发生，对西藏青稞生产造成了显著影响。低温胁迫包括冷害（0-15℃）和冻害（<0℃），冷害会使植物细胞膜硬化，破坏蛋白质稳定性，降低ROS清除酶活性，影响光合作用；而冻害则会造成更不可逆的损伤，严重时导致植株死亡。面对这些挑战，植物体内会转录产生大量RNA分子，包括编码RNA（mRNA）和非编码RNA（ncRNA），其中长链非编码RNA（LncRNA）作为一类长度超过200nt且不具备显著蛋白编码能力的转录本，在植物响应环境胁迫中扮演着重要角色。

目前，尽管在谷物（如大麦、小麦和燕麦）中LncRNA的功能研究仍处于起步阶段，但其在调控农艺性状（如产量、抗逆性和品质）方面的潜力已逐渐显现。青藏高原以其显著的海拔变化、多样的微气候和频繁的极端天气事件而闻名，青稞作为该地区的重要粮食作物，在生长发育过程中常常面临低温胁迫的挑战，严重影响其产量和品质。因此，探究青稞LncRNA在低温应答中的分子机制，对于培育耐冷、高产、稳产品种，保障青藏高原粮食安全，促进高寒地区农业可持续发展具有重要意义。

在这项发表于《BMC Plant Biology》的研究中，余明宅等人通过对两个青稞品种（耐冷型Zangqing 17和冷敏感型Zangqing 311）在六个温度梯度（24℃、12℃、5℃、0℃、-5℃、-8℃）下的36个样本进行RNA-seq分析，系统研究了青稞幼苗响应低温胁迫的转录组变化，特别是LncRNA和mRNA的调控机制。

研究人员主要采用了RNA-seq高通量测序技术，对来自西藏自治区农牧科学院的青稞品种进行低温处理，使用DEGseq进行差异表达分析，通过CPC、txCdsPredict、CNCI软件和pfam数据库预测转录本编码能力，采用GO和KEGG进行功能富集分析，运用qPCR验证基因表达，并利用WGCNA构建基因共表达网络。

青稞低温胁迫下生理指标变化

研究首先观察了两个青稞品种在低温胁迫下的形态变化，发现随着温度持续降低，两个品种均出现不同程度的萎蔫，其中冷敏感品种（CS）在5℃时叶片开始下垂，随着温度降低下垂越来越明显，在-5℃时发生萎蔫；而耐冷品种（CT）在面临低温时表现显著优于CS，在CS叶片下垂时CT叶片仍保持挺直，直到-8℃低温时CT才出现萎蔫。

生理指标分析显示，随着温度降低，耐冷和敏感品种的超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）均急剧增加，在0℃后下降，其中SOD的下降比POD更剧烈，且耐冷品种在各梯度含量均高于敏感品种。相对电导率（RCR）和可溶性蛋白（SP）随着温度降低逐渐增加，耐冷品种在各温度梯度含量均高于敏感品种，相对电导率在0℃后急剧增加，而可溶性蛋白增加缓慢。

青稞幼苗响应低温胁迫的LncRNA高通量测序鉴定

通过对36个青稞样本进行测序，平均每个样本产出12.65Gb数据，平均基因组比对率为79.65%。共检测到101,193个表达转录本，其中25,809个为LncRNAs，75,384个为mRNAs。通过四种预测方法（CNCI、CPC、PFAM和txCdsPredict）鉴定发现，LncRNAs的外显子数量少于mRNA转录本，大多数LncRNA转录本只有一个外显子，而mRNAs有两个或三个以上外显子。LncRNAs长度主要集中在100-500nt范围内，而mRNAs长度主要在500-2500nt之间。LncRNAs和mRNAs在2号和5号染色体上分布较多，mRNA的FPKM值显著高于LncRNA。

组间差异分析

研究人员以log₂Fold Change>1.00和Adjusted P-value<0.05为标准筛选差异表达的LncRNAs和mRNAs。在冷害组中，CT_24℃vs_5℃比较发现2,719个差异表达LncRNAs，其中581个上调，2,138个下调；14,444个差异表达mRNAs，其中4,246个上调，10,198个下调。CS_24℃vs_5℃比较发现2,563个差异表达LncRNAs，其中601个上调，1,962个下调；13,701个差异表达mRNAs，其中5,534个上调，8,167个下调。

在冻害组中，CT_0℃vs-8℃比较发现1,415个差异表达LncRNAs，其中250个上调，1,165个下调；6,790个差异表达mRNAs，其中1,551个上调，5,239个下调。CS_0℃vs-8℃比较发现1,301个差异表达LncRNAs，其中228个上调，1,073个下调；6,236个差异表达mRNAs，其中1,923个上调，4,313个下调。

为了确定低温胁迫下LncRNA表达的动态变化，研究人员发现冷害组四个比较中有568个LncRNAs在所有四个比较中均有表达，冻害组四个比较中有197个LncRNAs在所有比较中均有表达。

差异表达mRNA和差异表达LncRNA靶基因的注释和富集分析

GO富集分析显示，在CT_24℃vs_5℃、CS_24℃vs_5℃、CT_0℃vs-8℃、CS_0℃vs-8℃比较中，前三个富集结果相同。在生物过程（BP）中，最富集的是细胞过程、代谢过程和生物调节；在细胞组分（CC）中，仅细胞解剖实体和蛋白质复合物被富集；在分子功能（MF）中，富集的通路是结合、催化活性和转运蛋白活性。

KEGG通路分类显示，在CT_24℃vs_5℃比较中，mRNAs显著富集于植物-病原互作（ko04626）、淀粉和蔗糖代谢（ko00500）、氨酰-tRNA生物合成（ko00970）；CS_24℃vs_5℃比较中显著富集于植物-病原互作、光合作用-天线蛋白（ko00196）、淀粉和蔗糖代谢。在CT_0℃vs-8℃比较中，mRNAs显著富集于植物-病原互作（ko04626）、核苷酸糖生物合成（ko01250）、抗坏血酸和醛糖酸代谢（ko00053）；CS_0℃vs-8℃比较中显著富集于植物-病原互作（ko04626）、抗坏血酸和醛糖酸代谢（ko00053）、氨基糖和核苷酸代谢（ko00520）以及核苷酸糖生物合成（ko01250）。

对DE-LncRNA靶基因进行GO富集分析发现，在CT_24℃vs_5℃、CS_24℃vs_5℃比较中，GO富集分析结果相同：在BP中，最富集的是细胞过程、代谢过程和刺激响应；在CC中，仅细胞解剖实体和蛋白质复合物被富集；在MF中，富集的通路是结合、催化活性和转运蛋白活性。

DE-LncRNA靶基因的KEGG通路分类显示，CT_24℃vs_5℃比较显著富集于同源重组（ko03440）、DNA复制（ko03030）、核苷酸切除修复（ko03420）；CS_24℃vs_5℃比较显著富集于核苷酸糖生物合成（ko01250）、同源重组（ko03440）、核苷酸切除修复（ko03420）。CT_0℃vs-8℃比较显著富集于抗坏血酸和醛糖酸代谢（ko00053）、核苷酸糖生物合成（ko01250）；CS_0℃vs-8℃比较显著富集于抗坏血酸和醛糖酸代谢（ko00053）、葡萄糖醛酸相互转化（ko00040）、RNA聚合酶（ko03020）。

LncRNA靶基因预测

LncRNA的功能主要通过cis或trans模式作用于靶基因来实现。在冷害组中，共预测到1,904对LncRNA-mRNA对，其中1,152对通过cis配对（664对mRNA重叠，175对mRNA上游，313对mRNA下游），752对通过trans配对。冻害组中预测到922对LncRNA-mRNA对，其中473对为cis模式（261对mRNA重叠，90对mRNA上游，122对mRNA下游），449对为trans模式。

为了识别差异表达的LncRNA-mRNA对，研究人员将差异LncRNA靶基因与差异表达mRNAs进行交集分析，发现冷害组CT_24℃vs_5℃比较中有656个交集，CS_24℃vs_5℃比较中有668个交集。冻害组CT_0℃vs-8℃比较中有187个交集，CS_0℃vs-8℃比较中有146个交集。

通过分析冷害组中490个交集基因和冻害组中82个交集基因的功能，研究人员筛选出23个激酶和7个转录因子（bHLH112、WRKY71、RF2B、TFB1-1、MADS1、TCP20、PHL11）。热图分析发现，在冷害组中HvWRKY71呈下降趋势，在敏感品种中12℃时急剧升高然后趋于平稳；HvWRKY71在冻害组中不表达，而耐冷品种在冷害中平稳增加，在0℃冻害时仍表达。HvbHLH112在两个品种中随温度降低逐渐下降。

WGCNA分析识别低温相关枢纽基因

加权基因共表达网络分析（WGCNA）将具有相似表达模式的基因分类到模块中，以便更有效地研究具有相似性的基因。对冷害组中鉴定的8,497个LncRNAs和冻害组中6,656个LncRNAs进行WGCNA分析，结果显示共表达基因模块将冷害组中的基因分离为26个不同模块，其中turquoise模块（1,258个）基因最多，其次是blue模块（836个）。冻害组中的基因被分离为15个不同模块，其中turquoise模块（949个）基因最多，其次是blue模块（836个）。

通过分析模块特征基因与生理指标的相关性，研究人员发现冷胁迫下，SOD与black模块呈最高正相关（0.69），与green和turquoise模块呈最高负相关（-0.65）；POD与black模块呈最高正相关（0.75），与blue模块呈最高负相关（-0.81）；RCR与midnightblue模块呈最高正相关（0.87），与green和turquoise模块呈最高负相关（-0.7）；SP与midnightblue模块呈最高正相关（0.75），与turquoise模块呈最高负相关（-0.84）。

冻胁迫下，SOD与yellow模块呈最高正相关（0.83），与black模块呈最高负相关（-0.5）；POD与yellow模块呈最高正相关（0.49），与midnightblue模块呈最高负相关（-0.44）；RCR与black模块呈最高正相关（0.57），与blue模块呈最高负相关（-0.78）；SP与black模块呈最高正相关（0.72），与blue模块呈最高负相关（-0.9）。

本研究旨在深入分析与生理指标（SOD、POD、RCR、SP）显著相关的模块。在筛选过程中，鉴定出两个关键的枢纽长链非编码RNA（hub LncRNAs），并与预测的LncRNA-mRNA配对进行比较。在冷害处理组中，五个LncRNAs（XR006611493.1、LTCONS00012305与SOD、POD、RCR、SP呈正相关，而LTCONS00034478、LTCONS00063024、XR006630304.1与这些生理指标呈负相关）具有预测的mRNA配对。通过mRNA注释文件，确定LncRNA LTCONS00012305对应的mRNA为MYB家族转录因子HvPHL11。LTCONS00012305与其靶基因HvPHL11以Lnc-AntiOverlap-mRNA形式存在，而其他靶基因编码功能未知的蛋白质。

在冻害处理组中，鉴定出另外两个LncRNAs（LTCONS00004357与SOD和POD负相关，LTCONS00052975与SOD和POD正相关，与RCR和SP负相关）具有预测的mRNA配对。LTCONS00004357的配对mRNA是锌指CCCH结构域包含蛋白33-like，以cis mRNA dw10k形式存在。这些发现表明LTCONS00012305和HvPHL11可能参与调节植物在冷害下的应激反应。鉴于HvPHL11作为MYB家族转录因子在植物生长发育和应激反应中的重要性，LTCONS00012305可能通过调节HvPHL11的表达来影响植物的耐冷性。此外，LTCONS_00004357和锌指CCCH结构域包含蛋白33-like蛋白这对LncRNA-mRNAs可能参与调节植物的抗冻机制。

研究结论与意义

本研究通过对青藏高原重要粮食作物青稞在低温胁迫下的转录组分析，系统鉴定了25,809个LncRNAs和75,384个mRNAs，揭示了LncRNA在青稞低温应答中的重要作用。研究发现冷害组和冻害组分别鉴定出2,719和2,563个差异表达LncRNAs，预测了1,904对LncRNA-mRNA互作关系。GO/KEGG分析表明代谢过程、刺激响应通路以及抗坏血酸代谢通路（ko00053）在低温应答中显著富集，特别是抗坏血酸代谢通路在青稞响应冻害中发挥重要作用。

通过差异表达分析和WGCNA网络构建，研究筛选出HvWRKY71、HvbHLH112、HvPHL11等关键转录因子，发现LTCONS00033085（LncRNA）-HvWRKY71、XR006622464.1（LncRNA）-HvbHLH112等基因对可能通过调节ABA途径响应低温胁迫。这些发现不仅揭示了LncRNA通过调控抗氧化途径增强青稞低温适应性的分子机制，还为青稞抗寒育种提供了新的靶点和理论依据。

该研究的创新之处在于首次系统解析了青稞低温胁迫下LncRNA-mRNA调控网络，发现了多个参与低温应答的关键通路和转录因子，为理解青稞低温适应机制提供了新视角。这些研究成果将有助于培育耐冷、高产、稳产的青稞品种，对保障青藏高原粮食安全、促进高寒地区农业可持续发展具有重要意义。未来研究可进一步验证这些关键LncRNA的功能，探索其在青稞抗寒育种中的应用价值。