外周CB2受体激活通过血脑屏障外作用机制改善雄性小鼠实验性ALS的神经保护效应研究

本研究针对肌萎缩侧索硬化症（ALS）治疗中中枢CB2受体激活可能伴随的副作用问题，通过对比研究两种不同血脑屏障（BBB）通透性的CB2受体激动剂RO-6866945（中枢通透）和RO-6871304（外周限制），在SOD-1G93A和TDP-43A315T转基因ALS雄性小鼠模型中的治疗效果。研究发现外周限制性激动剂RO-6871304能显著保护脊髓运动神经元、减轻神经胶质反应性并恢复神经肌肉接头功能，其疗效与中枢通透激动剂相当。通过HPLC-MS分析证实RO-6871304不进入中枢神经系统，表明外周CB2受体（如骨骼肌和免疫细胞中的受体）是治疗ALS的重要靶点。该研究为开发无中枢副作用的ALS治疗新策略提供了重要理论依据。

　　

在神经退行性疾病研究领域，肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS）始终是一个极具挑战性的难题。这种疾病不仅导致上下运动神经元的进行性退化，还伴随骨骼肌去神经化和萎缩，最终造成患者完全瘫痪甚至死亡。尽管科学家们已经发现了超过40个与ALS相关的基因突变（如SOD1、TARDBP、FUS和C9orf72），但超过85%的病例仍属于散发性ALS，其发病机制复杂且治疗手段极其有限。

目前临床上使用的药物如利鲁唑（Riluzole）和依达拉奉（Edaravone）仅能有限延缓疾病进展，而2022年批准的AMX-0035组合疗法和针对SOD1突变的反义寡核苷酸Tofersen也仅对特定患者群体有效。近年来，大麻素类化合物在ALS治疗中展现出潜力，特别是靶向 cannabinoid type 2 receptor（CB2受体）的药物。以往研究认为CB2受体的神经保护作用主要集中在中枢神经系统内激活的小胶质细胞和星形胶质细胞上，但这种中枢作用可能带来潜在的神经心理副作用。

一个有趣的问题随之产生：既然ALS是一种同时影响神经和肌肉系统的疾病，且CB2受体在骨骼肌和免疫细胞中也有表达，那么是否可能通过激活外周CB2受体来实现神经保护效果，同时避免中枢副作用呢？这就是Gomez-Almería等人发表在《Cell Communication and Signaling》上的研究想要解答的核心问题。

研究人员采用了多种关键技术方法开展本研究：使用SOD-1^G93A和TDP-43^A315T转基因雄性小鼠作为ALS模型；通过腹腔注射给药方式分别使用中枢通透性CB2激动剂RO-6866945（30 mg/kg/天）和外周限制性激动剂RO-6871304（10 mg/kg/天）；采用旋转棒、悬挂线和握力测试等行为学评估方法；应用尼氏染色和免疫荧光染色（CHAT、GFAP、Iba-1、CD68标记）进行组织学分析；使用实时定量PCR技术分析肌肉组织基因表达；通过高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）技术检测药物在脑组织、脊髓和血浆中的分布；采用流式细胞术分析脊髓中浸润免疫细胞。

Treatment with the two agonists in SOD-1 Transgenic mice: neuroprotective effects

研究发现，在SOD-1^G93A转基因小鼠中，两种CB2受体激动剂治疗都显示出改善神经功能的趋势。RO-6866945（中枢通透性）在旋转棒测试（5-8周治疗后）、悬挂线测试（7-8周治疗后）和握力测试（7-8周治疗后）中都表现出一定的恢复趋势；而RO-6871304（外周限制性）也显示出类似但稍弱的改善趋势。两种治疗均能显著保护脊髓运动神经元，经尼氏染色和胆碱乙酰转移酶（CHAT）免疫荧光染色证实，两者效果相当。

在神经胶质激活方面，两种激动剂对星形胶质细胞标记物GFAP的影响有限，但对小胶质细胞标记物Iba-1和CD68的表达有显著调节作用。有趣的是，外周限制性激动剂RO-6871304在降低这两种小胶质细胞标记物方面表现更为显著。

Treatment with the two agonists in SOD-1 Transgenic mice: effects in skeletal muscle

对骨骼肌的研究发现，SOD-1转基因小鼠中多个肌肉功能相关基因表达异常，包括氧化应激标记物Gsr（谷胱甘肽二硫还原酶）、肌肉分化和再生标记物Col19A1（胶原蛋白XIXα1链）和Mef2（肌细胞增强因子2）、内吞作用标记物Snx10（分选连接蛋白10）以及钙信号标记物Calm1（钙调蛋白1）。两种激动剂对这些异常表达都有一定的调节作用，但各有侧重：RO-6871304对Col19A1的下调更为有效，而RO-6866945对Snx10的调节作用更强。

更重要的是，CB2受体编码基因Cnr2在SOD-1转基因小鼠肌肉组织中表达升高，而两种激动剂治疗都显示出下调趋势，其中RO-6871304效果更为明显。对胫骨前肌神经肌肉接头的分析显示，SOD-1转基因小鼠去神经化肌纤维比例显著增加，而两种激动剂治疗都能有效恢复神经肌肉接头 innervation（神经支配）状态。

Treatment with RO-6871304 in SOD-1Transgenic mice: effects in immune cells

流式细胞术分析发现，SOD-1转基因小鼠脊髓中CD45^high浸润免疫细胞（包括淋巴样细胞和髓样细胞）数量有升高趋势。然而，与预期相反的是，RO-6871304治疗并未减少这些浸润细胞的数量，甚至在某些情况下还显示出进一步增加的趋势。这表明外周限制性激动剂的 beneficial effects（有益效果）可能不是通过减少免疫细胞浸润实现的，而是可能通过调节这些细胞一旦浸润后的毒性功能。

Treatment with the two agonists in TDP-43 Transgenic mice

在TDP-43^A315T转基因小鼠模型中，两种激动剂的行为学效果相对较弱，仅在某些时间点显示出改善趋势。组织学分析显示，RO-6866945能部分保护脊髓运动神经元，而RO-6871304效果稍弱。在神经胶质激活方面，RO-6866945能有效降低小胶质细胞标记物Iba-1的表达，而RO-6871304对星形胶质细胞标记物GFAP仅有轻微下调趋势。

Analysis of the biodistribution of the two agonists in SOD-1 and TDP-43 Transgenic mice

最关键的研究发现来自药物分布分析。HPLC-MS分析明确显示，在SOD-1和TDP-43转基因小鼠中，中枢通透性激动剂RO-6866945在脑组织和脊髓中都有高浓度分布，而外周限制性激动剂RO-6871304在CNS组织中几乎检测不到，尽管它在血浆中有高浓度存在。这一发现彻底排除了RO-6871304通过受损血脑屏障进入CNS发挥作用的可能性，强有力地证实了其治疗效果确实是通过外周机制实现的。

本研究通过严谨的实验设计证明了外周CB2受体激活在ALS治疗中的重要价值。主要研究结论包括：第一，外周限制性CB2激动剂RO-6871304能够在不进入CNS的情况下，产生与中枢通透性激动剂RO-6866945相当的神经保护效果；第二，这种外周作用机制可能涉及骨骼肌CB2受体的激活，改善神经肌肉接头功能，并可能调节免疫细胞的活性；第三，通过HPLC-MS分析证实，在ALS疾病状态下，RO-6871304仍然保持其外周限制特性，不会因血脑屏障可能存在的损伤而进入CNS。

这些发现具有重要的理论和临床意义：理论上，它们挑战了ALS治疗中纯粹的中枢神经系统中心范式，揭示了外周组织在神经退行性疾病中的重要作用；临床上，它们为开发新一代ALS治疗药物指明了方向——通过靶向外周CB2受体，可以实现神经保护效果同时避免中枢副作用，大大提高治疗的安全性和耐受性。

该研究的创新性在于首次系统比较了中枢与外周CB2受体激活在ALS中的相对贡献，并提供了令人信服的证据支持外周机制的重要性。然而，研究人员也指出需要进一步研究来明确外周CB2受体发挥保护作用的具体细胞靶点（肌肉纤维、免疫细胞或其他外周细胞类型）和分子机制。此外，在女性动物模型、症状后治疗干预以及更多机制层面的研究也将是未来研究的重要方向。

总之，这项研究为ALS治疗策略提供了新视角，表明针对外周组织的治疗可能同样重要，甚至可能比单纯针对中枢神经系统的治疗更具优势。这一 paradigm shift（范式转变）可能不仅适用于ALS，还可能为其他神经退行性疾病的治疗提供新的思路。