人类骨骼肌纤维类型特异性甲基化与蛋白质组整合图谱揭示表观遗传调控新机制

本研究针对骨骼肌研究中纤维类型特异性DNA甲基化(DNAm)与蛋白质表达关系不明的难题，开发了同步提取DNA与蛋白质的新方法，通过对7名男性和5名女性的I型（慢肌）和II型（快肌）纤维进行EPICv2甲基化阵列和LC-MS/MS蛋白质组学分析，鉴定出5,689个差异甲基化区域和144个差异表达蛋白，发现甲基化水平与关键收缩代谢蛋白表达呈负相关，并建立了基于10个CpG位点的全肌肉样本纤维类型比例估算模型，为骨骼肌表观遗传研究提供了重要资源和工具。

　　

骨骼肌作为人体运动系统和代谢调节的核心器官，其功能主要由不同类型的肌纤维共同驱动。根据收缩特性和代谢方式的不同，骨骼肌纤维可分为慢缩型（Type I，TI）和快缩型（Type II，TII）两大类。这些纤维类型不仅决定了肌肉的收缩性能，还与整体代谢健康、运动适应和衰老过程密切相关。然而，在研究骨骼肌的分子调控机制时，科学家们面临着一个长期存在的技术挑战：如何从同一份样本中同时获取高质量的DNA甲基化信息和蛋白质表达数据，从而真正揭示表观遗传调控与功能蛋白表达之间的内在联系。

以往的研究大多使用全肌肉（whole-muscle，WM）样本进行分析，忽略了不同纤维类型之间的细胞异质性。这种研究方法存在明显局限，因为全肌肉样本实际上是多种纤维类型和其他细胞类型的混合体，其表观遗传特征可能受到纤维类型组成比例的显著影响。近年来，虽然已有研究开始关注纤维类型特异性的转录组和蛋白质组差异，但关于人类骨骼肌纤维类型特异性DNA甲基化的研究仍然十分有限。此前仅有的一项探索性研究样本量过小（n=1），且未能整合多组学数据。此外，大多数研究还存在性别不平衡问题，女性样本代表性不足。

为了突破这些技术瓶颈，由Andrew S. Palmer领衔的研究团队在《Skeletal Muscle》杂志上发表了一项创新性研究。他们开发了一种革命性的实验方法，能够从同一组肌纤维样本中同步提取DNA和蛋白质，从而实现对人类骨骼肌纤维类型特异性甲基组和蛋白质组的整合分析。

研究人员采用了几个关键技术方法：从12名参与者（7男5女）的股外侧肌中分离出200余根单根肌纤维，通过点印迹技术基于肌球蛋白重链（MYH）表达进行纤维分型；使用改良的酚-氯仿法从相同纤维池中同步提取DNA和蛋白质；采用Illumina EPICv2甲基化阵列分析超过800,000个CpG位点的甲基化状态；通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术定量分析1,226种蛋白质表达；应用EpiDISH算法建立基于DNA甲基化的纤维类型比例估算模型。

方法：同时提取DNA和蛋白质并进行纤维分型

研究团队成功建立了从同一组肌纤维中同步分离蛋白质和DNA的技术流程，获得了纯化的TI慢肌和TII快肌纤维群体。通过点印迹技术确认了纤维类型的特异性：TI纤维表达MYH7而不表达MYH2，TII纤维表达MYH2而MYH7表达量较低。从纤维池中提取的gDNA完整性良好，满足后续甲基化分析要求。

蛋白质差异：TI和TII纤维之间

蛋白质组学分析共鉴定到1,226种蛋白质，主成分分析显示TI和TII纤维明显分离。肌球蛋白亚型分析证实TI纤维主要表达MYH7（平均97%），而TII纤维主要表达MYH2（平均77%）。差异表达蛋白分析发现了144个"稳健DEPs"（调整后p<0.001且logFC>1），其中110个在TI纤维中上调，34个下调。这些蛋白主要涉及收缩功能和代谢通路，与既往研究结果一致但有所扩展。

DNAm差异：TI和TII纤维之间

甲基化分析揭示了11,188个"稳健DMPs"（调整后p<0.001且β值差异>10%），其中8,408个在TI纤维中高甲基化，2,780个低甲基化。差异甲基化区域（DMR）分析鉴定出5,689个"稳健DMRs"（Fisher P值<0.001），这些区域显著富集于肌肉发育分化和收缩纤维组织相关的基因本体术语。关键收缩基因如MYH7、TPM3、ATP2A2（TI）和MYH2、TPM1、ATP2A1（TII）都显示了纤维类型特异性的甲基化模式。

甲基组与蛋白质组之间的关系

研究发现DNA甲基化状态与蛋白质表达之间存在中度至强度的负相关关系（r=-0.58至-0.60）。高甲基化DMR与下调蛋白（如MYL4、TNNC2、TNNT3）相关，而低甲基化DMR与上调蛋白（如MYH7、ATP2A2、TNNI1）相关。这种关系在关键收缩和代谢基因中尤为明显，提示DNA甲基化在纤维类型特异性基因调控中发挥重要作用。

全肌肉DNAm特征受TI和TII纤维强烈影响

比较分析显示，全肌肉DNA甲基化特征介于TI和TII纤维之间，表明WM的甲基化信号受到纤维类型比例的强烈影响。这强调了在骨骼肌表观遗传研究中考虑纤维类型组成的重要性。

使用基于参考的去卷积法估算全肌肉中TI和TII纤维比例

研究人员利用纤维类型特异性DNAm数据建立了参考矩阵，可通过EpiDISH软件包估算全肌肉样本中的纤维类型比例。基于10个CpG位点的参考矩阵在训练集中表现出最佳预测性能（r=0.933，RMSE=0.052），在独立验证集（n=174）中也显示出良好效果（r=0.713，RMSE=0.099）。他们还开发了在线工具MyoTYPE（https://myometh.net/myotype），便于研究人员快速估算肌肉样本的纤维类型比例。

探索性分析：TI和TII纤维之间DNAm的性别差异

研究发现女性在TI纤维、TII纤维和全肌肉样本中普遍呈现高甲基化模式，与既往研究一致。TI纤维中发现了35个性别特异性DMR，TII纤维中发现了156个。其中26个DMR在所有条件下重叠，表明存在纤维类型非依赖性的性别差异调控。同时，也鉴定出少数纤维类型特异性的性别差异DMP，提示在WM DNAm研究中可能遗漏这部分信息。

本研究提供了首个人类骨骼肌纤维类型特异性的整合甲基组和蛋白质组图谱，揭示了DNA甲基化与蛋白质表达之间的强烈关联，特别是在关键收缩和代谢基因中。研究人员开发的纤维类型比例估算工具为未来骨骼肌表观遗传研究提供了重要的校正方法，有助于减少纤维类型组成带来的混杂效应。创建的在线资源MyoMETH（https://myometh.net）为科学社区提供了宝贵的数据平台，将推动对骨骼肌纤维类型调控机制的深入探索。

这项研究的创新之处在于突破了技术限制，实现了从同一纤维样本中同步获取多组学数据，并兼顾了性别平衡的实验设计。研究结果不仅增进了我们对骨骼肌纤维类型特异性表观遗传调控的理解，而且提供了实用的研究工具和丰富的数据库资源，为未来研究肌肉相关疾病、运动适应和衰老过程的分子机制奠定了坚实基础。