MSC分泌组中大小依赖性免疫调节新机制：小分子靶向天然免疫，大分子调控T细胞增殖

本刊推荐：为解决间充质基质细胞(MSC)分泌组中可溶性因子与细胞外囊泡(EVs)免疫调节功能不清的问题，Wong团队开展分泌组尺寸分馏功能研究。发现<5 kDa可溶性因子(如PGE2)通过抑制NF-κB和IRF通路调控天然免疫，而>100 kDa组分（含EVs）显著抑制CD3+ T细胞增殖。该研究为无细胞疗法的标准化提供关键理论依据。

　　

在再生医学领域，间充质基质细胞(MSC)因其强大的免疫调节能力被视为治疗自身免疫疾病和组织损伤的明星细胞。然而，细胞治疗存在的储存困难、免疫排斥和肿瘤风险等瓶颈，促使科学家将目光转向无细胞疗法——MSC分泌组。这个包含可溶性因子和细胞外囊泡(EVs)的复杂混合物，虽展现出治疗潜力，但其内在机制却如同一个“黑箱”：究竟是哪些成分在起作用？它们如何分工协作？这些问题至今悬而未决。

更令人困扰的是，当前EV研究领域缺乏标准化流程。从生产、纯化到功能验证，不同实验室的方法各异，导致研究结果难以比较和重复。特别是下游处理过程中，常用的切向流过滤(TFF)和超速离心等技术会不可逆地改变分泌组的组成，但这种改变对功能的影响却鲜有系统研究。正是为了解决这些根本问题，Wong等人在《Stem Cell Research & Therapy》上发表了他们的最新研究成果。

研究团队采用了一套多维度技术体系：利用3D微载体培养系统大规模生产人脂肪源MSC分泌组；通过切向流过滤(TFF)进行不同分子量截留（5、10、30、100 kDa）的精细分馏；采用超速离心分离可溶性成分与EVs；借助纳米颗粒跟踪分析(NTA)、冷冻电镜(cryoTEM)和MACSPLEX芯片全面表征颗粒特性；并创新性地建立了双重功能验证平台——通过THP-1 Dual报告细胞系检测NF-κB和IRF通路抑制情况，同时采用CFSE染色流式术分析CD3⁺ T细胞增殖抑制。所有功能实验均使用法国血液机构提供的健康 donor 外周血单核细胞(PBMCs)。

验证PBMC筛选检测方法用于EVs的抗炎特性

研究人员首先建立并验证了高通量筛选平台。研究发现，虽然新鲜PBMCs对分泌组的反应更敏感，但冻存PBMCs仍能保持稳定的趋势性和可重复性，支持其用于大规模筛选。该检测显示NF-κB活化程度与PBMCs分泌的TNF-α和IL-1β水平高度一致，证实了THP-1 Dual细胞系可作为PBMCs反应的可靠替代指标。

TFF浓缩分泌组降低生物活性蛋白水平并削弱抗炎特性

研究发现，澄清分泌组(PC)比TFF浓缩后(PT)样品具有更强的NF-κB抑制活性，尽管两者的颗粒浓度和尺寸分布无差异。蛋白组学分析揭示PC中多种信号蛋白（如细胞因子和趋化因子）的浓度显著高于PT，表明TFF过程去除了大部分可溶性因子。这些可溶性因子的丢失直接导致了免疫调节功能的减弱。

超速离心上清和澄清分泌组展现NF-κB通路抑制特性，与沉淀EVs形成对比

通过超速离心进一步分离可溶性成分(SN)和EVs沉淀，研究发现PC和SN均能显著抑制NF-κB通路，而纯化的EVs反而表现出轻微的促炎趋势。这一发现直接证明了对天然免疫的调节作用主要来自可溶性因子，而非EVs。

小于5 kDa的可溶性因子负责免疫调节效应

研究团队采用不同截留分子量的TFF膜（5、10、30、100 kDa）处理分泌组。令人惊讶的是，所有TFF浓缩样品都失去了NF-κB抑制能力，但却都保留了抑制CD3⁺ T细胞增殖的能力。这表明：小于5 kDa的可溶性因子调控天然免疫，而大于100 kDa的大分子组分（很可能包含EVs）负责适应性免疫调节。

PGE2部分介导MSC分泌组的抗炎活性

在众多小分子可溶性因子中，研究人员重点分析了前列腺素E2(PGE2)和犬尿氨酸。检测发现PC中含有高浓度PGE2(1904 pg/mL)，而TFF处理后急剧下降至84.5 pg/mL。功能实验表明，添加外源性PGE2能恢复PT样品的抗炎活性，而使用抑制剂TG4-155和GW627368X则能阻断PC的抗炎效果，证实PGE2是介导抗炎效应的关键分子之一。

本研究得出了一个颠覆性的结论：MSC分泌组的免疫调节功能存在明显的“尺寸分工”。小分子可溶性因子（如PGE2）主要负责调控天然免疫通路，而大分子组分（如EVs或蛋白复合物）则主导T细胞功能的调节。这种机制上的区分对无细胞疗法的开发具有重大意义。

首先，它解释了为什么不同制备方法得到的MSC产物功能差异巨大——下游处理工艺会不可逆地改变分泌组的成分组成和比例。其次，它提示单一的效价检测不足以评估分泌组的全面功能，必须针对不同的治疗目的（抗炎或免疫抑制）设计相应的评价体系。最后，该研究为标准化生产提供了理论指导：针对天然免疫相关疾病，应保留小分子可溶性因子；而针对T细胞介导的疾病，则需富集大分子组分。

这项研究不仅揭示了MSC分泌组复杂作用机制的关键一环，也为未来开发精准、高效的无细胞治疗方案奠定了坚实基础，推动再生医学向更加可控和标准化的方向迈进。