犬源脂肪间充质干细胞小细胞外囊泡通过β细胞再生改善糖尿病小鼠模型的系统功能研究

本研究探讨了3D培养的犬脂肪间充质干细胞(cAD-MSCs)来源的小细胞外囊泡(sEVs)对链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病小鼠的治疗潜力。研究发现sEVs通过保护β细胞、改善胰岛素敏感性和恢复免疫稳态，显著改善血糖控制、减轻系统炎症并修复多器官功能。该研究为糖尿病及其并发症的细胞无治疗提供了新策略。

　　

糖尿病 mellitus(DM)作为一种慢性代谢性疾病，已成为影响人类和动物健康的重要公共卫生问题。据统计，犬糖尿病患病率高达0.29-0.36%，其病理特征与人类1型糖尿病(T1D)相似，主要表现为胰腺β细胞破坏导致的胰岛素分泌不足。尽管胰岛素治疗能够暂时控制血糖水平，但无法从根本上恢复β细胞功能，患者仍需面对心血管疾病、神经病变、肾病和视网膜病变等严重并发症的威胁。

在这一背景下，再生医学领域迎来了新的希望——小细胞外囊泡(small extracellular vesicles, sEVs)。这些直径约50-300纳米的纳米级囊泡，作为细胞间通讯的重要媒介，能够携带蛋白质、脂质和核酸等生物活性分子，在组织修复和免疫调节中发挥关键作用。特别是间充质干细胞(MSCs)来源的sEVs，因其低免疫原性和强大的再生能力，已成为糖尿病治疗研究的新焦点。

近日，Parkpoom Siriarchavatana等研究人员在《BMC Veterinary Research》上发表了一项突破性研究，首次系统评估了3D培养的犬脂肪来源间充质干细胞(cAD-MSCs)产生的小细胞外囊泡(sEVs)对糖尿病治疗的效果。研究团队通过全面的体外和体内实验，揭示了sEVs在保护β细胞、改善葡萄糖代谢和恢复免疫稳态方面的独特优势，为糖尿病治疗提供了新的思路。

研究采用的关键技术方法包括：通过3D培养系统规模化生产cAD-MSCs来源的sEVs，结合透射电子显微镜(TEM)、纳米颗粒跟踪分析(NTA)和纳米流式细胞术进行sEVs表征；建立依托泊苷(ETO)诱导的INS-1β细胞损伤模型评估sEVs的保护作用；利用链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病小鼠模型进行体内疗效验证；通过葡萄糖耐量试验(IPGTT)、稳态模型评估(HOMA)指数和血液生化分析等多维度指标评估治疗效果。

Characteristics of small extracellular vesicles produced from 3D culture of cAD-MSCs

研究团队首先对3D培养的cAD-MSCs来源的sEVs进行了全面表征。透射电镜显示sEVs呈现典型的杯状形态，粒径约72±3.46纳米，zeta电位为-21.15±0.84毫伏，表明其具有良好的胶体稳定性。纳米颗粒跟踪分析显示颗粒浓度达到1.07×10⁹颗粒/毫升，蛋白浓度为157.93±25.21微克/毫升，颗粒与蛋白比率为0.68×10⁷颗粒/微克蛋白，证实了高质量sEVs的成功制备。

Establishment of etoposide-induced cytotoxicity in INS-1 cells

为评估sEVs对β细胞的保护作用，研究团队建立了依托泊苷(ETO)诱导的INS-1细胞毒性模型。剂量反应分析显示，ETO处理48小时后半数抑制浓度(IC₅₀)为0.78±0.06微克/毫升。形态学观察显示，ETO处理导致细胞密度降低和结构破坏，特别是在5和10微克/毫升浓度下表现出显著细胞毒性。选择1微克/毫升ETO(48小时IC₉₀)进行后续实验，为评估sEVs的保护效果提供了理想的损伤模型。

Low-dose sEVs revitalize etoposide-induced cytotoxicity in INS-1 cells

研究发现低剂量sEVs(10⁴颗粒/毫升，sEV4)对ETO诱导的细胞毒性具有显著保护作用。7天实验期间，sEV4处理使细胞死亡率降至0.24±0.01/天，显著低于ETO组(0.33±0.03/天)。第7天时，sEV4组细胞存活率达到24.39±3.26%，明显高于ETO组(13.89±2.41%)。Live/Dead染色结果进一步证实，sEV4处理组显示更多活细胞(绿色荧光)，而死细胞(红色荧光)数量最少。值得注意的是，较高剂量的sEV5和sEV6保护效果反而不如低剂量，显示出反向剂量依赖性效应。

0.05,*;p≤0.05).Abbreviation:sEVs;small extracellular vesicles produced by 3D culture of cAD-MSCs'>

Biodistribution study of sEVs in mice via intravenous administration

药代动力学研究显示，静脉注射后sEVs在血液循环中表现出良好的滞留特性。注射后1小时血浆浓度为6.34±0.51×10⁵颗粒/毫升，6小时达到峰值(12.22±0.41×10⁵颗粒/毫升)，24小时仍保持稳定水平(12.23±0.16×10⁵颗粒/毫升)。这种长效循环特性为sEVs的持续治疗效果提供了保障，同时所有实验小鼠在整个研究期间均保持临床正常状态，证实了sEVs给药的安全性和耐受性。

sEVs alleviate hyperglycemia in STZ-induced diabetic mice

体内实验结果表明，sEVs治疗显著改善了STZ诱导的糖尿病小鼠的血糖控制。双剂量组(2sEV)表现最为突出，空腹血糖(FBG)从第-1天的709.00±28.54毫克/分升降至第21天的514.10±44.96毫克/分升。三剂量组(3sEV)也显示出明显改善，而单剂量组(1sEV)效果相对有限。体重监测显示，双剂量组生长速率(0.051±0.012克/天)最接近正常组(0.131±0.017克/天)，表明sEVs治疗有助于代谢功能的恢复。

0.05,;p≤0.05,*;p≤0.01).Abbreviation:sEVs;small extracellular vesicles produced by 3D culture of cAD-MSCs,AU;arbitrary unit,HOMA-β;homeostasis model assessment forβ-cell function,HOMA-IR;homeostasis model assessment for insulin resistance,and QUICKI;quantitative insulin sensitivity check index'>

sEVs increase glucose metabolism in STZ-induced diabetic mice

葡萄糖耐量试验(IPGTT)结果显示，sEVs治疗显著改善了糖尿病小鼠的葡萄糖代谢能力。双剂量组在120分钟时表现出最佳的葡萄糖清除效果，血糖水平从15分钟的703±47毫克/分升降至586.67±104.91毫克/分升。这表明sEVs主要通过增强外周组织对葡萄糖的利用来改善糖代谢，而非直接刺激β细胞分泌胰岛素。

sEVs restoreβ-cell function and insulin sensitivity in STZ-induced diabetic mice

稳态模型评估(HOMA)结果显示，sEVs治疗显著改善了β细胞功能和胰岛素敏感性。双剂量组在HOMA-β(0.19±0.02 AU)、HOMA-IR(0.18±0.03 AU)和QUICKI(1.46±0.08 AU)指标上均表现出最佳恢复效果，表明sEVs能够同时靶向β细胞功能恢复和胰岛素敏感性改善。

sEVs improve hematological, renal, and hepatic parameters in STZ-induced diabetic mice

sEVs治疗还显著改善了糖尿病相关的血液学、肾脏和肝脏参数异常。糖尿病小鼠表现出的血细胞比容升高(65.53±0.66%)、白细胞计数增加(6.17±0.25×10³细胞/毫米³)等血液学异常，在sEVs治疗后得到明显改善。肾功能指标如肌酐水平在双剂量组显著降低，肝脏酶学指标也显示恢复趋势。

0.05,*;p≤0.05).Abbreviation:sEVs;small extracellular vesicles produced by 3D culture of cAD-MSCs,MLR;monocyte-to-lymphocyte ratio, NLR;neutrophil-to-lymphocyte ratio,PLR; platelet-to-lymphocyte ratio, Sll; Systemic immune-inflammation index, SIRI;Systemic inflammatory response index, and PIV; pan-immune inflammation value'>

sEVs restore immune homeostasis in STZ-induced diabetic mice

主成分分析(PCA)显示，双剂量和三剂量sEVs治疗组在炎症标志物分布上与正常组最为接近，表明sEVs能够有效恢复免疫稳态。糖尿病组表现出的系统性炎症和免疫失衡特征，在sEVs治疗后得到显著改善。

sEVs mitigate dysregulated bile stasis diabetic mice

器官形态学观察发现，糖尿病小鼠出现明显的胆囊扩大和胆汁淤积现象，而sEVs治疗显著改善了这些异常，反映了肝胆功能的恢复。

sEVs ameliorate inflammation,fibrosis,and preserve islets in STZ-induced diabetic pancreas

组织病理学分析显示，sEVs治疗显著改善了胰腺组织的病理改变。三剂量组表现出最佳的胰岛数量(0.50倍)和面积(0.70倍)恢复，同时炎症浸润和纤维化程度明显减轻。正常组胰岛结构完整，而糖尿病组出现严重胰岛萎缩、脂肪浸润和纤维化，sEVs治疗组则显示出剂量依赖性的组织修复效果。

研究结论与讨论部分强调了sEVs作为糖尿病治疗新策略的重要价值。该研究首次证实了cAD-MSCs来源的sEVs通过多靶点作用机制改善糖尿病病理状态的能力。特别值得注意的是，低剂量sEVs(10⁴颗粒/毫升)在体外实验中表现出最佳保护效果，这种反向剂量依赖性效应可能与细胞摄取机制和受体饱和效应有关。

在作用机制方面，sEVs可能通过其携带的microRNAs(如miR-21、miR-29、miR-125)、热休克蛋白(HSPs)和抗氧化物质等活性成分，抑制凋亡通路、稳定线粒体膜电位并中和活性氧(ROS)，从而保护β细胞免受损伤。同时，sEVs还能够调节PI3K/Akt和AMPK信号通路，增强胰岛素敏感性，并通过调控炎症因子表达促进免疫稳态恢复。

该研究的创新之处在于建立了3D培养系统规模化生产sEVs的技术平台，产量达到传统2D培养系统的2倍以上。双剂量给药方案显示出最佳治疗效果，为空腹血糖控制、胰岛功能恢复和多器官保护提供了优化策略。

然而，研究也存在一定局限性，如sEVs具体作用机制尚未完全阐明，长期安全性和免疫原性需要进一步评估。未来研究应聚焦于sEVs活性成分的鉴定、给药方案的优化以及大型动物模型的验证，推动这一创新疗法向临床转化。

总体而言，这项研究为糖尿病及其并发症的细胞无治疗提供了坚实证据，展示了sEVs在再生医学领域的广阔应用前景。通过β细胞 revitalization、代谢功能改善和免疫调节的多重作用机制，sEVs有望成为糖尿病治疗的新突破点，为患者带来更好的治疗效果和生活质量。