多顺反子载体中RAX与OTX2在CRX后的连接顺序对体外光感受器样细胞直接转化效率的影响研究

本研究针对体细胞重编程为光感受器样细胞（PRLs）过程中存在的诱导效率低、细胞成熟度异质性大及病毒载体损伤等问题，开发了包含CRX、RAX、NeuroD1和OTX2的多顺反子载体。通过比较不同基因排列顺序（CNOR/CNRO/CRNO）发现，CNRO与CRNO载体能显著提升光感受器相关基因（S-antigen、PDE6C、GNAT2等）表达水平及Ca2+内流活性，证实转录因子排列顺序对PRLs诱导效能具有关键调控作用，为视网膜退行性疾病细胞治疗提供新策略。

　　

通过转录因子过表达重导体细胞分化，为从体细胞获取目标细胞提供了一种前景广阔、简便且低成本的策略。本研究团队前期证实，结合CRX、NeuroD1和RAX是将人真皮成纤维细胞重编程为光感受器样细胞（PRLs）的必要条件，而OTX2则扮演放大器的角色。然而，基于逆转录病毒的转录因子递送系统存在诱导效率相对较低、诱导产生的PRLs成熟度不均一以及细胞损伤等问题。采用包含四种转录因子——CRX（C）、RAX（R）、NeuroD1（N）和OTX2（O）——的多顺反子载体替代先前使用的单顺反子载体混合物，有望克服这些局限。研究人员将三种不同基因排列顺序（CNOR、CNRO或CRNO）的多顺反子逆转录病毒载体，或四种转录因子的单顺反子逆转录病毒载体混合物，导入商业化的人真皮成纤维细胞系HDF-a中。通过免疫细胞化学（ICC）检测，发现pMXs-CNOR-IP、pMXs-CNRO-IP和pMXs-CRNO-IP转导的细胞之间，四种转录因子的表达水平无显著差异。采用qRT-PCR技术在转导后第10、14和28天检测了蓝视蛋白、S抗原、GNAT2、PDE6C、CNGA3和恢复蛋白的表达情况。结果显示，在pMXs-CNRO-IP和pMXs-CRNO-IP载体转导的细胞中，所有基因均清晰表达；而在pMXs-CNOR-IP载体转导的细胞中，S抗原、PDE6C和GNAT2在整个观察期间表达水平均较低。钙成像实验表明，任一种多顺反子载体诱导的PRLs，其Ca²⁺内流均显著高于未转导细胞。多顺反子载体上转录因子的排列顺序能够影响光感受器相关基因的表达水平。相较于CNOR，CNRO或CRNO的排列可能更有利于光感受器诱导，这提示RAX和OTX2在多顺反子载体上的相对顺序，可能对体外PRLs诱导效能的调控至关重要。仍需进一步研究以确定这些转录因子在多顺反子载体中表达时是否彼此相互作用。