呼吸道微生物组研究中RNA提取方法的优化：化学与机械联合裂解法提升宏转录组测序效能

本研究针对呼吸道样本微生物生物量低、宿主RNA占比高的技术难题，系统评估了化学裂解(CL)与化学-机械联合裂解(CML)两种RNA提取方法对第三代测序的宏转录组分析的影响。研究发现CML法显著提高dsDNA文库产量和测序读长数，尤其增强了对革兰氏阳性菌和真菌的检测能力，为呼吸道微生物组的功能研究提供了关键方法学优化。

　　

呼吸道是人体与外界环境直接接触的重要门户，其微生物群落包括细菌、真菌和病毒等成员，与呼吸道健康和各种疾病状态密切相关。然而，由于呼吸道样本中微生物生物量通常很低，且宿主RNA占绝对主导，使得全面、准确地解析呼吸道微生物组的真实组成和功能活动面临巨大挑战。传统的基于DNA的扩增子测序（宏条形码技术）虽能描绘细菌和真菌的群落结构，却难以有效研究病毒群落，也无法提供微生物群落的功能活性信息。宏转录组学（Metatranscriptomics）技术应运而生，它通过直接对样本中的全部RNA进行测序，不仅能鉴定出活跃的微生物物种（包括RNA病毒），还能揭示其基因表达谱，为了解微生物群落的功能及其与宿主的相互作用提供了强大工具。尤其随着第三代测序技术（如纳米孔测序）的发展，长读长宏转录组学使得解析全长转录本成为可能，信息量更为丰富。然而，宏转录组学应用的成功高度依赖于第一步——能否从样本中高效、无偏地提取出高质量的RNA，这尤其考验着对不同结构微生物（如易裂解的病毒与具有坚韧细胞壁的细菌、真菌）的裂解策略。

为了攻克这一技术瓶颈，Alice Michel及其合作团队在《BMC Genomics》上发表了他们的最新研究成果。他们以支气管肺泡灌洗液（BAL，代表下呼吸道）和鼻咽拭子（NPS，代表上呼吸道）样本为研究对象，精心设计实验，比较了两种代表性的RNA提取方法：一种是仅使用化学裂解（CL）的病毒RNA提取试剂盒，另一种是结合了化学裂解与机械珠磨破碎（CML）的广谱核酸提取试剂盒。研究不仅评估了不同样本输入体积（200μL与400μL）的影响，还设置了已知组成的阳性对照（包含8种细菌、2种真菌和2种RNA病毒），以客观评估提取方法对微生物检测准确性的影响。通过系统分析RNA产量、dsDNA文库产量、测序读长数量与质量、读长长度以及微生物分类学组成等多个关键指标，旨在为呼吸道宏转录组学研究推荐最优的RNA提取方案。

本研究采用的关键技术方法主要包括：从法国鲁昂大学医院中心收集的BAL和NPS临床样本制备混合池；分别使用化学裂解（CL）和化学-机械联合裂解（CML）两种试剂盒进行RNA提取，并考察不同样本输入体积；通过全转录组扩增（WTA）和牛津纳米孔技术（Oxford Nanopore Technologies）的MinION平台进行长读长测序；利用Kraken2和Bracken等生物信息学工具进行微生物分类学分析；并采用统计学方法比较不同提取方法的效果。

The CML protocol provides a higher dsDNA library yield in respiratory samples

研究发现，尽管CL法提取后测得的RNA浓度显著高于CML法（p<0.0001），但经过后续的cDNA合成、全转录组扩增和文库制备后，CML法产生的双链DNA（dsDNA）文库浓度却显著高于CL法（p<0.0001）。

这表明CL法提取的RNA中可能含有某些酶抑制物（如RNAlater中的高浓度盐分），影响了后续的酶促反应效率。增加样本输入体积（从200μL到400μL）并未显著提高dsDNA文库产量。

The CML protocol provides a higher sequencing yield without altering read length or quality in respiratory samples

与dsDNA文库产量的结果一致，测序数据显示，CML法产生的有效测序读长数量显著高于CL法（p<0.0001）。

重要的是，两种方法在测序读长的质量（通过过滤率的读长比例衡量）和读长中位数（即读长长度）上均无显著差异，证明CML法在提升产量的同时，并未牺牲长读长测序的数据质量。样本输入体积的增加同样未显著提升测序读长数。

The CML protocol provides a closer taxonomic profile of the positive control

对阳性对照的分析显示，CML法能更准确地反映其理论基因组组成。

特别是对于细胞壁较厚的微生物，如革兰氏阳性菌（如粪肠球菌Enterococcus faecalis, 单核细胞增生李斯特菌Listeria monocytogenes）和真菌（如新型隐球菌Cryptococcus neoformans, 酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae），CML法的检测率显著优于CL法（p值均小于0.05）。CL法则严重低估了这些微生物的丰度。两种方法均能有效检测出RNA病毒（HIV和SARS-CoV-2）。

The CML protocol optimizes the respiratory microbiome study

对实际呼吸道样本的微生物组成分析表明，BAL样本中宿主读长占主导（平均72.14%），NPS样本中宿主读长比例较低（平均14.22%），提取方法对宿主读长比例无显著影响。

在属水平上，两种提取方法检测到的主要细菌类群（如BAL中的罗氏菌属Rothia、假单胞菌属Pseudomonas、链球菌属Streptococcus；NPS中的黄杆菌属Flavobacterium、短波单胞菌属Brevundimonas等）相对丰度无显著差异。

然而，CML法展现出对特定微生物更好的检测灵敏度，例如在部分BAL池中独家或更清晰地检测到马拉色菌属Malassezia和念珠菌属Candida等真菌，在NPS样本中更稳定地检测到棒状杆菌属Corynebacterium和惰性球菌属Dolosigranulum等革兰氏阳性菌。Alpha多样性指数（Shannon指数）在两种方法间无显著差异。

综上所述，本研究通过严谨的实验设计和多维度评估，证实了化学-机械联合裂解（CML） protocol在呼吸道样本宏转录组学分析中的优越性。CML法不仅能显著提高测序数据产量，更重要的是，它能更有效地裂解具有坚韧细胞壁的微生物（如革兰氏阳性菌和真菌），从而实现对呼吸道微生物群落更全面、更无偏的检测，且不损害长读长测序的数据质量。尽管未能显著降低宿主读长的比例，但其提升的总测序通量意味着在相同测序深度下能获得更多的微生物信息。因此，对于旨在全面解析呼吸道活跃微生物群落（包括细菌、真菌和病毒）及其功能的研究，尤其是在微生物生物量低的样本中，推荐采用CML法进行RNA提取。这项研究为呼吸道微生物组领域提供了关键的方法学优化和决策依据，将有力推动对呼吸道微生物组在健康和疾病中作用的深入理解。