基于MRI影像组学诺莫图预测HER2阳性乳腺癌CD8+肿瘤浸润淋巴细胞水平的创新研究及其免疫治疗意义

本研究创新性地开发并验证了基于动态对比增强磁共振成像（DCE-MRI）的影像组学诺莫图模型，通过整合放射组学特征与临床影像特征（肿瘤边缘和强化模式），成功实现了对HER2阳性乳腺癌患者CD8+肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）水平的精准预测。该模型在训练组和验证组分别达到0.866和0.886的曲线下面积（AUC），显著优于单一临床影像模型（p<0.05），为无创评估肿瘤免疫微环境（TIME）及筛选免疫治疗获益人群提供了重要工具。

　　

引言

乳腺癌（BC）是一种高度异质性的恶性肿瘤，其生物学特性与预后和治疗反应密切相关。近年来，免疫治疗和免疫检查点阻断在乳腺癌临床管理中受到广泛关注。与传统化疗和放疗相比，免疫治疗不良反应发生率较低，患者耐受性更好。然而，免疫治疗的疗效存在差异，仅部分乳腺癌患者表现出反应。因此，预测性生物标志物对于识别真正受益于免疫治疗的乳腺癌患者至关重要。

肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）是肿瘤免疫微环境（TIME）的重要组成部分，在肿瘤发生、进展、转移和耐药过程中发挥重要作用，被认为是癌症患者免疫浸润和预后的生物标志物。现有证据表明，TILs的存在与乳腺癌和其他实体瘤患者的良好预后相关。

T淋巴细胞包括CD8⁺T细胞、CD4⁺辅助T细胞和调节性T细胞，是TILs中分布最广泛的免疫细胞类型。CD8⁺T细胞在TIME中执行关键细胞毒功能，并介导对免疫检查点抑制剂（ICIs）的反应。在乳腺癌管理中，ICIs已显示出改善患者临床结局的价值，肿瘤内CD8⁺T细胞基线密度的增加与对免疫治疗的良好反应相关。

在不同分子亚型的乳腺癌中，人表皮生长因子受体2（HER2）阳性乳腺癌已被证明具有高免疫原性，约55%的肿瘤基质中含有高水平的TILs。一项临床试验显示，新辅助化疗后HER2阳性乳腺癌患者较高的TILs水平与病理完全缓解率和总生存期（OS）的增加密切相关。此外，增加的TILs表明HER2阳性乳腺癌患者对HER2靶向治疗的反应更好。Hou等人的研究表明，高CD8⁺TILs水平与HER2阳性乳腺癌患者OS延长呈正相关，提示CD8⁺T细胞介导的细胞毒免疫反应可能预测标准化疗和HER2阻断治疗后的更好临床结局。因此，术前精确评估CD8⁺TILs水平对于指导HER2阳性乳腺癌患者的精准治疗策略具有重要意义。

目前，乳腺癌CD8⁺TILs水平的评估依赖于手术切除或穿刺活检获得的组织标本的免疫组化（IHC）染色。然而，这些侵入性且不可重复的测量方法存在创伤或并发症的风险，限制了其在临床状况不佳的患者中的应用。因此，寻找一种准确、非侵入性和可重复的方法来评估TILs水平可能有助于预测HER2阳性乳腺癌患者的临床结局，这些患者可能不仅受益于新辅助或抗HER2靶向治疗，还可能受益于免疫治疗。

近年来，影像组学作为一种从医学图像中提取和分析大量定量图像特征的有前景的计算医学成像技术已经出现。动态对比增强磁共振成像（DCE-MRI）是检测乳腺癌最敏感的成像方式，使其适合影像组学的临床应用。许多研究已经证明了DCE-MRI影像组学在区分良恶性乳腺肿瘤、乳腺癌分子分型、评估腋窝淋巴结状态以及预测预后和治疗反应方面的应用。然而，据我们所知，尚未有研究使用DCE-MRI影像组学预测HER2阳性乳腺癌的CD8⁺TILs水平。本研究的目的是探讨结合临床影像和DCE-MRI影像组学特征构建的影像组学诺莫图在预测HER2阳性乳腺癌CD8⁺TILs水平方面的潜力。

材料与方法

患者

这项回顾性研究经大坪医院伦理委员会批准[批准号：2023（06）]。回顾性收集了2019年1月至2022年7月期间经组织学证实为HER2阳性的158例乳腺癌患者的临床和影像数据，最终126例符合纳入和排除标准的患者纳入本研究。纳入标准包括：（1）年龄18岁及以上的女性患者；（2）经病理证实为原发性HER2阳性乳腺癌；（3）患者接受了术前或活检前DCE-MRI检查；（4）DCE-MRI显示可见乳腺肿块，最大直径大于1.0厘米。排除标准包括：（1）临床或病理数据不完整；（2）DCE-MRI前接受过化疗、免疫治疗或放疗；（3）DCE-MRI图像质量差；（4）DCE-MRI上表现为非肿块样强化。患者按7:3的比例随机分为训练组（n=88）和验证组（n=38）。流程图如图1所示。

MRI技术

所有患者均使用1.5T扫描仪（Magnetom Aera，西门子医疗，埃尔兰根，德国）进行双侧乳腺MRI检查。MRI协议包括：T1WI（TR/TE=8.6ms/4.7ms，FOV=360mm×360mm，矩阵大小=384×384，层厚=4.0mm）；脂肪抑制T2WI（TR/TE=5600ms/57ms，FOV=340mm×340mm，矩阵大小=320×320，层厚=4.0mm）；DCE-T1WI（TR/TE=4.62ms/1.75ms，FOV=360mm×360mm，矩阵大小=320×320，层厚=1.5mm）。增强扫描中使用Gd-DTPA（Magnevist，拜耳医疗，柏林，德国）作为对比剂，通过高压注射器以0.1 mmol/kg的剂量和2.0 ml/s的流速注入肘静脉。注射对比剂后，以相同流速注射15ml生理盐水。共连续采集七个时相（一个基础对比前时相和六个连续对比后时相），无间隔。每个扫描持续时间约为60秒，总共约7分钟。

临床数据

收集了以下临床数据：年龄、绝经状态、临床TNM分期、组织学类型、组织学分级、Ki67表达（低表达<20%；高表达≥20%）、雌激素受体（ER）状态和孕激素受体（PR）状态。ER和PR阳性定义为至少1%的肿瘤细胞核染色。

CD8⁺TILs的评估遵循2014年国际TILs工作组的建议。整个载玻片在低倍镜（50×）下扫描，通过细胞膜上淡黄色至棕色粗颗粒染色识别CD8⁺TILs。然后，随机选择五个高倍视野（200×）根据肿瘤基质中阳性淋巴细胞的百分比评估CD8⁺TILs表达，并计算平均值作为整个肿瘤区域CD8⁺TILs的平均水平。分析过程中避免了热点区域。由于目前对CD8⁺TILs的阈值尚无共识，使用中位数作为 cutoff值。本研究中CD8⁺TILs的中位数为30%，因此CD8⁺TILs表达≤30%为低水平，标记为（-），>30%为高水平，标记为（+）。所有IHC载玻片由我院两位分别具有8年和10年乳腺病理经验的病理医师共同分析，分歧通过协商解决。两位病理医师在审阅载玻片前均不知晓临床和影像数据。

MRI解读

在不知晓临床和组织病理学结果的情况下，两位放射科医师（读者1和2，分别具有10年和8年乳腺影像经验）独立审阅MRI数据。统计时如发现两位读者意见不一致，则通过协商讨论达成共识。基于BI-RADS MRI词典记录MRI特征，包括肿瘤最大直径（在肿瘤最大层面测量）、形状（椭圆形、圆形和不规则形，分叶状合并为椭圆形）、边缘（光滑边缘为清晰，不规则和毛刺边缘为不清晰）、背景实质强化（BPE）[首次对比增强序列所见正常背景实质强化的视觉评估分为最小（<25%）、轻度（25%-50%）、中度（51%-75%）或显著（>75%）]、强化模式（均匀指整个肿块内融合均匀强化；不均匀指信号强度可变非均匀强化；边缘强化指周边强化比中心更明显）、时间-强度曲线（TIC）模式（持续型定义为随时间推移信号强度持续增加超过10%；平台型定义为初始上升后信号强度随时间不变；流出型定义为从初始上升的最高信号强度下降超过10%）和腋窝淋巴结大小[在脂肪抑制T2WI序列中选择最大的腋窝淋巴结，通过在医院图像存档与通信系统（PACS）上手动勾画淋巴结在最大层面的整个边界来测量其最大横截面积]。

肿瘤分割和特征提取

如前人研究建议，乳腺恶性病变与周围腺体背景的对比在注射对比剂后约60-180秒达到峰值。本研究选择DCE-MRI的第三个对比后时相（DCE-MRI_phase3）进行肿瘤分割。首先，使用3D-Slicer软件（版本4.11.20210226，https://www.slicer.org/）中插件“N4偏置场校正”和“图像强度滤波器”模块校正偏置场并标准化图像强度。放射科医师1使用3D-Slicer软件通过沿肿瘤边界手动勾画每层感兴趣区域（ROI）获得三维感兴趣体积（VOI）。放射科医师2对随机选择的40个肿瘤进行ROI勾画。放射科医师1在1个月后对随机选择的图像进行第二次ROI勾画。勾画过程中，尽力排除肿瘤周围正常组织，但包括出血和坏死区域。所有VOI重采样至体素大小1.0×1.0×1.0 mm，灰度直方图的bin宽度固定为25进行图像离散化。使用五个拉普拉斯高斯滤波器（即内核大小μ设为1、2、3、4、5）和基于小波变换的滤波器（LLL、LLH、LHL、HLL、LHH、HLH、HHL、HHH）处理DCE-MRI图像。使用开源软件包“Pyradiomics”在Python 3.7（https://www.python.org/）上进行影像组学特征提取，包括七大类别：形状特征、直方图、灰度共生矩阵（GLCM）、灰度游程矩阵（GLRM）、灰度区域大小矩阵（GLSZM）、邻域灰度色调差矩阵（NGTDM）和灰度依赖矩阵（GLDM）。从每个VOI共提取1218个影像组学特征。这些特征符合图像生物标志物标准化倡议参考手册（ISBI）的指南。

影像组学诺莫图构建

仅使用观察者内组内相关系数（ICC）和观察者间ICC大于0.75的影像组学特征进行进一步分析。使用达尔文研究平台（https://www.yizhun-ai.com/），采用四步程序选择训练组的最终影像组学特征：（a）所有特征通过最大绝对值归一化进行预处理；（b）使用“Select K Best”特征选择模块降低特征维度；（c）使用最大相关最小冗余（mRMR）算法保留前20个特征；（d）最后，使用具有5折交叉验证的最小绝对收缩和选择算子算法（LASSO）筛选出最优特征。

在训练组中，将选定的影像组学特征及其相应的LASSO回归系数通过加权线性组合建立Rad-score，并通过单变量逻辑回归分析每个肿瘤的Rad-score以构建影像组学模型。同时，进行单变量和多变量逻辑回归分析以确定独立的临床影像因素。仅将单变量分析中P<0.05的因素纳入多变量分析。这些显著因素用于构建临床影像模型。最后，使用多变量逻辑回归结合临床影像特征和Rad-score构建影像组学诺莫图模型。训练组构建的每个模型的性能在验证组中进行验证。

统计分析

使用SPSS和R软件进行统计分析。使用Kolmogorov-Smirnov检验和Levene检验评估数据的正态性和方差齐性。正态分布的连续数据以均数±标准差（SD）表示，非正态分布数据以中位数（四分位距）表示。组间比较使用独立样本t检验或Mann-Whitney U检验。分类数据以频数和百分比表示，组间比较使用卡方检验或Fisher精确检验。使用Medcalc 20.0绘制受试者工作特征（ROC）曲线，并计算曲线下面积（AUC）、敏感性、特异性和准确性以评估模型性能。使用Delong检验比较不同模型间的AUC差异。使用“psych”包计算ICC，使用“rms”包进行校准曲线，使用“devtools”包进行决策曲线分析（DCA）。p<0.05认为有统计学意义。

结果

患者特征和临床影像模型

52.4%的患者（66/126）为低CD8⁺TILs水平，47.6%（60/126）为高CD8⁺TILs水平。训练组和验证组乳腺癌患者的临床和影像特征如表1和表2所示。在这些特征中，训练组和验证组中N分期、最大直径、肿瘤边缘和强化模式存在显著差异，训练组中T分期也存在显著差异（p<0.05）。具有低和高CD8⁺TILs水平的HER2阳性乳腺癌的经典MRI特征如图2和图3所示。在训练组中，单变量分析显示几个风险因素与CD8⁺TILs水平显著相关，包括T分期、N分期、最大直径、肿瘤边缘和强化模式（p<0.05）。多变量回归分析显示肿瘤边缘和强化模式是独立风险因素（p<0.05）。由这两个变量构建的临床影像模型的AUC在训练组和验证组分别为0.785[95%置信区间（CI）：0.690-0.881]和0.803（95% CI：0.654-0.951）。

特征选择和Rad-score模型

从每个VOI共提取1218个影像组学特征。去除观察者间和观察者内ICC≤0.75的特征后，获得1093个特征。在训练组中，使用Select K Best算法和mRMR算法进行降维。最后，通过LASSO回归算法选择了7个特征，包括1个形状特征、2个一阶统计特征和4个纹理特征（图4）。在训练组和验证组中，高CD8⁺TILs水平的Rad-score显著高于低CD8⁺TILs水平（p<0.001）（图5）。Rad-score模型在预测CD8⁺TILs水平方面表现出良好性能，在训练组和验证组的AUC分别为0.853（95% CI：0.771-0.935）和0.822（95% CI：0.686-0.958）。Rad-score公式如下：

Rad-score=1.326×log-sigma-3-0-mm-3D_firstorder_Kurtosis-1.236×log-sigma-2-0-mm-3D_gldm_SmallDependenceLowGrayLevelEmphasis+1.075×wavelet-LHL_glszm_SmallAreaHighGrayLevelEmphasis+1.039×wavelet-LHL_firstorder_Mean +0.960×wavelet-HLH_glcm_Imc2 + 0.833×original_shape_Maximum2DDiameterColumn-0.760×log-sigma-4-0-mm-3D_glcm_Imc1-1.770。

影像组学诺莫图模型

基于选定的临床影像风险因素（肿瘤边缘和强化模式）和Rad-score构建了影像组学诺莫图模型（图6）。校准曲线（图7）显示影像组学诺莫图模型预测的高CD8⁺TILs水平的概率值与真实值吻合良好。Hosmer-Lemeshow检验显示影像组学诺莫图模型在训练组（p=0.837）和验证组（p=0.600）校准良好。DCA显示影像组学诺莫图模型在临床应用中的价值高于临床影像模型和Rad-score模型（图7）。表3总结了不同模型预测CD8⁺TILs水平的有效性。训练组和验证组的三个模型的ROC曲线如图7所示。影像组学诺莫图模型取得了最佳的预测性能，在训练组和验证组的AUC分别为0.866（95% CI：0.792-0.941）和0.886（95% CI：0.778-0.994）。在训练组中，Delong检验显示影像组学诺莫图模型的诊断性能显著高于临床影像模型（p=0.016），而影像组学诺莫图与Rad-score模型之间无显著差异（p=0.550）（表4）。

讨论

在本研究中，我们通过整合Rad-score和常规MRI特征，建立并验证了一个基于MRI的影像组学诺莫图，用于预测HER2阳性乳腺癌的CD8⁺TILs水平。该影像组学诺莫图模型在区分HER2阳性乳腺癌低和高CD8⁺TILs水平方面表现出良好的性能，在训练组和验证组的AUC分别为0.866和0.886。这些发现表明，基于MRI的影像组学诺莫图可以作为一种经济、有效且非侵入性的工具，用于对可能受益于免疫治疗的HER2阳性乳腺癌患者进行分层。

本研究中，表现出较高CD8⁺TILs水平的肿瘤显示出显著更高的临床T分期和N分期，表明这些肿瘤具有更高程度的恶性。在形态学方面，本研究发现具有较高CD8⁺TILs水平的肿瘤往往表现出更长的直径、更不清晰的边缘和不均匀的强化。然而，需要注意的是，其他研究人员的结论与本研究存在一些差异。Pujani等人认为直径大于5厘米的乳腺癌的TILs水平显著升高，并且其研究人群中HER2阳性乳腺癌亚型的比例为16.83%（17/101）。Bian等人得出结论，较小的肿瘤直径与较高的TILs水平相关，并且其研究人群中HER2阳性乳腺癌的比例仅为7.14%（11/154）。我们的研究结论与前者相似而与后者不同的原因可能是我们纳入的研究人群均为HER2阳性乳腺癌患者。Choi等人观察到肿瘤边缘与TILs水平之间没有关联，但他们将ER阴性/HER2阳性乳腺癌患者的TIL水平分为三组（低：<10%，中：10-50%，高：>50%）。此外，Celebi等人观察到表现出高TILs的肿瘤与低TILs的肿瘤相比表现出更均匀的强化。然而，在Celebi的研究中，HER2阳性乳腺癌的比例仅为5.06%（8/158），并且强化模式未通过多变量逻辑回归分析确定。最值得注意的是，他们的研究包括了不同类型的乳腺癌，并且只关注TILs，而不是CD8⁺TILs。利用单变量和多变量逻辑回归分析，我们确定了肿瘤边缘和强化模式是高CD8⁺TILs水平的独立预测因子。基于这两个因素构建的临床影像模型在训练组和验证组分别显示出0.785（95%置信区间[CI]：0.690-0.881）和0.803（95% CI：0.654-0.951）的曲线下面积（AUC）。

影像组学近年来已成为肿瘤研究领域的流行研究工具。该方法涉及从医学图像中提取高通量定量特征，有助于识别通过视觉评估难以辨别的肿瘤内细微变化。一些先前的研究已使用影像组学预测乳腺癌的TILs水平。Yu等人从数字乳腺X线照片开发了一个影像组学模型，在训练组（AUC=0.830）和验证组（AUC=0.790）中对TILs水平表现出优异的预测性能。Tang等人报道，从延迟期MRI（特别是DCE_Phase6）提取的特征与其他时相的特征相比，提供了关于TILs浸润程度的更优信息。然而，这些先前的工作仅讨论了所有分子亚型乳腺癌的整体TILs水平。相反，本研究首次尝试基于DCE-MRI_Phase3图像开发影像组学诺莫图以预测HER2阳性乳腺癌的CD8⁺TILs水平。

在本研究中，Rad-score模型使用七个特征构建，这些特征主要来源于原始图像的高斯滤波和小波变换。在训练组和验证组中，高CD8⁺TILs水平组的rad-score显著高于低CD8⁺TILs水平组。这些发现可归因于CD8⁺TILs是细胞毒性T细胞，产生γ干扰素，从而产生肿瘤炎症环境，如中心坏死和水肿。因此，具有较高水平CD8⁺TILs的肿瘤往往具有更不均匀的强化模式。在本研究中，rad-score模型在训练组和验证组分别达到0.853和0.822的AUC来区分高和低水平的CD8⁺TILs。Arefan等人使用来自TCIA和TCGA数据库中73例乳腺癌患者的成像和基因表达数据，通过构建多变量逻辑回归模型建立了影像组学特征与肿瘤免疫细胞丰度之间的关系。结果显示，CD8⁺T细胞丰度的预测AUC在交叉验证和外部独立验证组中分别为0.740和0.620。本研究中预测CD8⁺TILs水平的更高AUC可能归因于该研究专注于特定的BC分子亚型并包含了更多的患者样本。

本研究显示，基于rad-score和临床影像特征（肿瘤边缘和强化模式）的影像组学诺莫图模型在预测HER2阳性乳腺癌CD8⁺TILs水平方面表现出最佳性能。在训练组中，影像组学诺莫图模型的效率显著高于临床影像模型，且差异具有统计学意义（p=0.016）。尽管影像组学诺莫图模型略高于rad-score，但它们之间没有统计学显著性（p>0.05）。这一发现表明影像组学特征是影像组学诺莫图的重要组成部分，而常规影像数据对模型改进的价值有限。

本研究存在几个局限性。首先，该研究是回顾性的，数据收集可能存在固有偏差。其次，这是一项单中心研究，病例数量有限，缺乏外部验证。第三，本研究缺乏患者治疗反应和预后的信息。未来的研究将在多中心进一步探讨不同CD8⁺TILs水平的HER2阳性乳腺癌患者中DCE-MRI影像组学特征与治疗反应或预后之间的关系，以增强我们发现的临床适用性。

结论

总之，本研究表明，基于MRI的影像组学诺莫图在预测HER2阳性乳腺癌CD8⁺TILs水平方面具有良好的性能。我们的发现为指导HER2阳性乳腺癌患者的免疫治疗展示了广阔的前景，值得进一步深入研究。