共刺激通路阻断下食蟹猴异位心脏移植后白细胞动态变化及其与排斥机制关联研究

本文系统分析了食蟹猴异位心脏移植模型中，不同共刺激通路阻断剂（靶向CD80/CD86、CD28、CD40、CD154）对受体外周血（PB）、移植周淋巴结（LNs）及移植物浸润淋巴细胞（GILs）动态变化的调控作用。研究揭示了中性粒细胞、单核细胞及嗜酸性粒细胞在排斥期的显著扩增，以及GILs中CD8+效应记忆T细胞、CD4+CD8+ T细胞和IgD?CD27? B细胞的富集现象，为探索排斥新机制和免疫耐受策略提供了关键线索。

　　

引言

cynomolgus monkey（食蟹猴）模型是预测阻断不同共刺激通路的单克隆抗体如何影响人类同种异体移植物存活时间及相关免疫机制的有用工具。在没有干预的情况下，异位心脏移植在猴模型中约7天后被排斥，而在本研究中，使用各种共刺激通路阻断剂后，大多数受体的移植物存活期持续延长超过90天。白细胞随时间的波动反映了生理免疫机制对移植手术诱导的早期促炎应激效应的适应性反应，以及对持续暴露于移植物抗原所感知的免疫“威胁”的反应，这些反应叠加在不同的共刺激阻断免疫抑制（IS）治疗的影响之上。在心脏异位移植后，与IS抗体治疗相关的外周血白细胞动态以及淋巴结（LNs）或移植物浸润淋巴细胞（GILs）中淋巴细胞亚群的调节此前尚未有深入报道。

材料与方法

研究设计

本研究回顾性分析了2008年至2016年间进行的同种异体移植实验。共纳入13只接受不同共刺激通路阻断治疗方案（移植物存活期延长超过80天，定义为“有效”治疗）的猴子，以及2只未接受治疗的对照猴子。受试者接受四种主要“平台”CD40/CD154或CD28/B7导向的共刺激通路阻断抗体治疗之一：抗CD40（2C10R4）、抗CD154（hu5c8）、抗CD28（FR104）或CTLA4-Ig Fc构建体（belatacept）。部分治疗组猴子还接受了补充治疗。心脏移植物根据排斥标准切除，除两只功能良好的移植物按当时方案在第90天切除。所有实验程序均获得相关动物护理和使用委员会的批准。

异位心脏移植与治疗 regimens

腹腔内异位心脏移植手术如前所述。移植物心脏监测和同种异体移植物切除标准见补充信息。详细给药方案如下：2C10R4在术后第0、3、7、14天给予30 mg/kg，第21、28、35、42天给予10 mg/kg，第56和84天给予20 mg/kg。hu5c8给药方案类似。Belatacept在术后第0、4、7、14、21、28、42、56、70和84天给予5或10 mg/kg。FR104给药方案与belatacept类似。

样本采集与处理

在移植当天（D0）和移植物切除当天，切除移植物附近的肠系膜淋巴结（LNs）。采集的LNs称重后通过35μm不锈钢网筛。收集的细胞进行计数并通过流式细胞术进行表征。

从切除的心脏中取20克样本用于分离GILs。分离的淋巴细胞进行计数并通过流式细胞术表征。

在移植前（基线，BL）和移植后第1、7、14、21、28、43、49和56天（“移植后间隔期”）采集的外周血（PB）样本中的白细胞进行分析。此后每1-2周分析一次的白细胞进行回顾性评估，时间点相对于移植物切除（排斥背景下n=11，或按方案切除n=2）设定为D?20–24、D?5–10、EXPLANT、D + 7、D + 14-21和D + 28-35（“围排斥间隔期”）。

流式细胞术与统计分析

对于每个时间点和样本类型（血液、LNs、GILs），使用34种荧光标记抗体组织成10个流式 panel。为了便于对不同时间点或位置（PB、LNs或GILs）的淋巴细胞亚群进行有意义的比较，每个样本的结果均来自相同数量的10,000个CD3细胞或1,000个B淋巴细胞（使用FCS Express-7中的加权降采样软件工具获得）。使用FCS Express-7软件的k-means方法对CD3 CD127^lowCD25^highFoxp3⁺细胞群进行聚类分析。使用双尾t检验分析各参数相对于基线的不同时间点之间或切除时不同位置之间的统计学差异。p < 0.05认为有统计学意义。

结果

外周血白细胞动态

白细胞（WBC）在移植后显著增加（第+7天p < 0.001）。在持续的免疫抑制治疗期间，移植后间隔期的其余时间，WBC计数通常在第56天前下降至基线水平。与基线相比，WBC在围排斥期显著增加，从D?20–24的1.38倍（p < 0.05）到排斥前D?5–10的1.59倍（p < 0.001），直至切除时的1.47倍（p < 0.001）。移植物切除后，WBC计数从围排斥期峰值趋于下降，但在切除后第+7天仍高于基线（1.3倍；p < 0.05）。

中性粒细胞（N）和单核细胞（M）是移植后初期白细胞增多的主要原因。N、嗜酸性粒细胞（E）、M和淋巴细胞（Ly）在围排斥期均增加。在所有治疗组中，PB中的嗜酸性粒细胞在移植物排斥时增加，在belatacept组中最为明显。嗜酸性粒细胞在移植后和围排斥间隔期的相对增加在切除时达到峰值，平均比基线高13.3倍（p < 0.01），随后在移植物切除后消退。

与N、E或M相反，Ly在移植后第一周显著下降，然后逐渐增加，在移植后第二或第三个月趋于高于基线水平，并在切除前一周（第5-10天；相对于基线p < 0.05）显著升高。与2C10R4或FR104治疗相比，在5c8和belatacept治疗中观察到更显著的PB Ly扩增。与PB Ly的切除前峰值相比，切除时循环淋巴细胞绝对数量下降。在切除后随访中，PB Ly计数与基线相比无显著差异。

在两只未治疗、移植物在第7天排斥的猴子中，WBC在第+1天增加，在切除当天略有下降，此后直至切除后35天普遍下降，模式与治疗动物相似。中性粒细胞在POD7排斥时保持升高，然后在切除后14-21天下降至基线水平。未经治疗，PB Ly数量在移植后第一天下降，并且在切除后35天内始终低于治疗猴子。在治疗猴子中切除时观察到的E或M的相对扩增在未治疗猴子中未见。

外周血淋巴细胞亚群动态

与基线相比，CD3⁺ T细胞数量在D+1短暂下降，然后在D7前增加，并在移植后随访期间普遍保持升高，在切除前一周达到峰值（p < 0.05）。随后CD3在切除当天下降至基线水平，然后在切除后随访期间再次呈上升趋势。基于抗CD154和抗CD28的治疗在移植后阶段与抗CD40或belatacept治疗的猴子相比，CD3细胞扩增程度较低。对于belatacept治疗，CD3 T细胞数量在移植物衰竭时相对于其他治疗组或未治疗猴子继续保持在较高水平。

B细胞数量也在D+1下降（p < 0.001），但与CD3细胞不同，在移植后第一个月保持在低水平，然后在D41前后恢复至接近基线。B细胞也倾向于在切除前一周达到峰值，然后在切除后恢复期间下降至基线水平。在belatacept和hu5c8为基础的治疗中，B细胞数量往往高于其他治疗组。对于其他治疗组，总体B细胞数量在移植物排斥时与基线相比没有显著偏离。

主要由一只2C10R4治疗的动物和一只belatacept治疗的动物的变异驱动，NK细胞在切除前D?20与基线相比似乎显著增加（p < 0.05）。在研究其余期间，PB中NK细胞扩增的趋势在其他组中无统计学意义。

外周血CD3⁺ T细胞亚群动态

在大多数治疗猴子中，PB CD4细胞在移植后随时间下降，并且在切除时低于基线，而CD8细胞数量呈增加趋势。因此，平均而言，PB中的CD4⁺/CD8⁺比率从基线的1.28趋于下降至移植物切除时的1.05；在这两个观察点之间，肠系膜LNs中的CD4⁺/CD8⁺比率也从3.11下降至2.87。

有效的共刺激通路阻断治疗与CD127^lowCD25^highFoxp3⁺细胞的增加相关：CD4细胞（推定的Treg CD4细胞）从基线的0.61%增至切除时的0.84%（1.3倍），CD8细胞从0.06%增至0.26%（4.06倍），CD4⁺CD8⁺细胞从0.12%增至0.38%（3.1倍）。

移植物浸润淋巴细胞亚群比较

基于排斥的心脏同种异体移植物平均重量39.6克，以及每克消化心脏组织平均产生100万个GILs，估计移植物内淋巴细胞总数约为3960万个。经校正后，排斥的心脏移植物在切除时平均含有1250万个活CD3细胞；其中，有373万个CD4细胞，676万个CD8细胞，174万个CD4⁺CD8⁺细胞，和5万个CD4^?CD8^?细胞，以及594万个B细胞。

在排斥时的移植物中，与PB或LNs相反，CD8细胞占CD3细胞的百分比最高（p < 0.001），而CD4细胞百分比最低（p < 0.001）。因此，GILs中的CD4/CD8比率为0.5，而当时PB中为1.29，LNs中为2.86。CD4⁺CD8⁺ DP细胞占切除时CD3⁺ GILs的13.92%，是血液中（3.49%）的4倍，LNs中（2.54%）的5.5倍。

基于CD4或CD8亚类CD3细胞表面CD62的表达，在切除的移植物中，活化CD8⁺CD62^?细胞的百分比高于LNs（p < 0.05）或PB（p < 0.05），而静止CD4 CD62⁺细胞百分比在GILs中小于LNs（p < 0.001）或血液（p < 0.001）。GILs中含有较小百分比的CD4和CD8 CD62⁺ 初始T细胞（T_N）（CD28⁺CD95^?），相对于LNs（p < 0.001）或血液（p < 0.01）。相反，CD4和CD8 CD62^? 效应记忆T细胞（T_EM）（CD28^?CD95⁺）以及CD8⁺ 中央记忆细胞（T_CM）（CD62^?CD28⁺CD95⁺）T细胞在GILs中的百分比增加（p < 0.05），相对于PB或LNs。

在排斥移植物中的CD127^lowCD25^highFoxp3⁺细胞中，30%为CD4⁺，21%为CD8⁺，49%为CD4⁺CD8⁺；GILs中CD4和CD8单阳性推定Treg之间的比率为1.4。GILs中CD4 CD127^lowCD25^highFoxp3⁺推定CD4 Treg细胞的百分比（来自CD3细胞的1.36% ± 0.27%）与血液相比有所增加（在基线时高2.2倍，在切除时高1.6倍），但低于LNs（在基线时低3.5倍，在切除时低3.9倍）。推定Treg CD8细胞（CD127^lowCD25^highFoxp3⁺）在GILs中富集，相对于PB（与基线PB相比高15倍，与切除时PB相比高3.7倍）或比基线LNs高1.7倍，但在切除时与LNs中的比例大致相同（比率1.1）。GILs中CD4/CD4 Treg细胞的比率为22，而CD8/CD8 Treg细胞的比率为56。

对GILs、LNs和PB之间CD3 CD127^lowCD25^highFoxp3⁺细胞亚群（CD4、CD8和DP）的聚类分析（14个簇）发现，GILs中DP细胞的两个簇和CD8细胞的三个簇数量显著增加。例如，GILs中DP推定调节性细胞的簇2包含82个细胞，而PB（8个细胞）或LNs（6个细胞）中较少（p < 0.001）。同样，与PB或LNs相比，GILs中CD8⁺ CD127^lowCD25^highFoxp3⁺细胞在簇1、3和5中的数量增加。在hu5c8治疗的猴子中，注意到CD8细胞簇2在GILs中数量增加。与PB相比，LN和GILs中簇4的DP细胞富集（p < 0.001）。对于CD4⁺Cd127^lowCD25^highFoxp3⁺细胞，簇4和8在LN中富集，相对于GILs或PB（p < 0.001）。

B细胞

与移植事件相关的PB B细胞下降反弹比T细胞慢。在切除时，GILs中B细胞的百分比低于PB（p < 0.01）或切除时的LNs（p < 0.001）。双阴性IgD^?CD27^? B细胞的百分比在GILs中高于PB（p < 0.01）或LNs（p < 0.05），而初始、记忆或活化B细胞的百分比在GILs中低于LNs或PB。

讨论

移植后外周血和淋巴结中各种白细胞亚群的动态变化，以及与排斥时心脏同种异体移植物内值的比较，反映了免疫系统在IS治疗背景下对持续暴露于移植物抗原以及手术操作诱导的促炎应激的复杂协调反应。本研究的结果与传统的同种异体移植排斥范式一致，并提供了新的相关数据。这项初步研究中对三个区室（PB、LNs和GILs）结果的比较，就IS方案之间的差异产生了几个可检验的工作假设，具有机制和治疗意义。

将PB简化为白细胞的易获取生物运输介质，移植后和围排斥期WBC的显著增加代表了其固有群体动态的累积结果。在稳定移植物功能的最初56天期间以及切除前后，不同白细胞群体描述的变化在治疗组间的猴子中通常显示出相似的模式，尽管存在与治疗相关的幅度差异，尤其是在belatacept和hu5c8中尤为突出。

结果提示先天免疫细胞在经共刺激通路阻断治疗的非人灵长类动物（NHPs）心脏同种异体移植排斥中具有突出作用。首先，移植后中性粒细胞数量因手术应激反应出现初始短暂增加后，在移植物排斥和切除前后出现另一个中性粒细胞峰值。这种模式在belatacept组似乎减弱。其次，单核细胞在移植后和围切除期也在PB中扩增。推测这些先天免疫监视细胞是由移植手术相关的全身应激和排斥期间局部炎症产生的细胞因子动员的。在排斥前后PB单核细胞数量的第二次增加提示该群体参与移植物损伤，值得进一步研究。第三，研究结果特别关注嗜酸性粒细胞，其在排斥预期和关联期间在外周血中持续发生相对扩增，尤其是在belatacept组。嗜酸性粒细胞参与多种免疫介导疾病的发病机制，也是心脏、肺、肾和肝移植后移植物排斥的相关因素。其在排斥免疫机制中的参与可能包括其作为抗原呈递细胞的作用，其细胞因子分泌谱可能影响T细胞增殖、单核/巨噬细胞活化和B细胞抗体产生。观察到嗜酸性粒细胞数量因不同治疗而异，推测嗜酸性粒细胞增多可能是一部分移植受者有效的排斥机制。

根据移植免疫学经典理论，淋巴细胞是适应性免疫反应的主要载体。推测移植后第一天PB中Ly的下降反映了其向移植物、移植物引流淋巴结和脾脏的净迁移，这在治疗和未治疗动物中均有观察到。在阻断共刺激通路（阻止“第二信号”，减少致病性同种免疫，并在不同程度上促进移植物保护性外周免疫调节的出现）的背景下，观察到Ly计数反弹至基线或以上。在移植物衰竭预期中PB Ly计数的上升，特别是在hu5c8和belatacept组（治疗在第84天后停止），可能反映了循环供者特异性淋巴细胞库的扩增。这种增加在与两只仍在用药的2C10R4治疗动物按计划在第84天切除的搏动移植物中未见。推测随后在切除前后PB Ly的下降反映了扩增的供者反应性Ly亚群向移植物内迁移的隔离，推测是去介导同种异体移植物排斥。CD3 T细胞和B细胞亚群遵循与Ly相似的动态，在移植程序后在PB中呈现较低数量。然而，CD3 T细胞在移植后约7天反弹至基线，而B细胞需要约40天恢复。PB中CD3 T细胞亚群的进一步分析确定了CD8细胞相对于CD4的比例稳步增加，CD4/CD8比率的变化与猪-to-NHP胰岛异种移植模型中观察到的相似。

淋巴结，尤其是靠近移植物的淋巴结，是供者抗原呈递给T细胞以及随后供者特异性淋巴细胞增殖的关键部位。与经典移植免疫学模型一致，观察到在排斥时LNs中CD4⁺CD62^? T细胞（推测主要为“辅助”表型）相对于基线相对扩增，而CD4⁺CD62⁺ 初始细胞群体减少。排斥时LNs中CD8⁺ T细胞群体数量上趋于更高，可能是迁移至移植物的致病性供者特异性效应细胞的主要来源。总体观察结果与CD8细胞从外周血迁移至同种异体移植物是诱导细胞性移植物损伤的主要效应器的经典工作模型一致。切除时LNs中B细胞百分比的增加可能说明其随时间推移在向T细胞呈递供者抗原和产生抗供者抗体方面的作用日益增强。

据推测，移植物内的T细胞亚型可能介导移植物命运，因为移植物是测量排斥效应与移植物保护性免疫调节机制之间平衡的逻辑位置。排斥的移植物显示出较小百分比的CD4细胞和较高百分比的CD8细胞，相对于PB或LNs，这些发现与啮齿类动物模型和临床研究中细胞介导的同种异体移植排斥的先前描述一致。粘附分子CD62L表达的丧失与淋巴细胞归巢至淋巴结或炎症期间的细胞活化有关。在移植物水平上，CD8⁺CD62^? T细胞中中央记忆（CD28⁺CD95⁺）和效应记忆（CD28^?CD95⁺）细胞比例较高，进一步强化了活化效应CD8细胞在局部排斥机制中的主要作用。比较切除时移植物与PB中的淋巴细胞，移植物相对富集CD127^lowCD25^highFoxp3⁺细胞（在CD4、CD8和CD4⁺CD8⁺细胞中分别富集1.6倍、3.7倍和5.7倍，相对于切除时PB；相对于基线PB分别富集2.2倍、15倍和18倍）。令人惊讶的是，双阳性CD4⁺CD8⁺（DP）T细胞在排斥移植物中约占CD3⁺细胞的13.9%，而血液中为3.5%，LNs中为2.5%，提示优先归巢或移植物内扩增。DP淋巴细胞（推测为未成熟）通常不在胸腺外大量发现。其在外周血中数量的增加与多种病理状况相关，包括癌症、自身免疫性疾病、病毒感染，以及在非人灵长类动物胰岛移植模型中的移植物排斥。GILs中高比例DP T细胞的意义尚不清楚。对移植后CD8、CD4和双阳性GIL群体中CD127^lowCD25^highFoxp3⁺细胞亚群的进一步表征，与PB或LNs比较，有潜力增强我们对移植物排斥机制的理解，或为达到耐受提供新的治疗靶点。B细胞已知参与抗体反应，也参与抗体非依赖性功能，如调节T细胞分化、通过抗原呈递促进T细胞存活、调节巨噬细胞表型以及产生调节性（抗炎和促炎）细胞因子。排斥时移植物中B细胞低百分比值得进一步研究。GILs中高比例双阴性（IgD^?CD27^?）B细胞的作用（在自身免疫性和感染性疾病患者中也观察到）仍然是推测性的。GILs中初始、记忆和活化B细胞百分比较低可能具有重要意义。

新的白细胞亚群的发现将导致诊断或对抗排斥的新方法的开发。鉴定具有特定特性的推定新细胞亚群可能预示排斥或表明需要改变治疗方案以维持耐受。对其表型和功能更精细的定义可能对先天性和适应性免疫排斥机制产生新见解。本研究提出的聚类分析可能是这方面的一个例子。

结论

外周血白细胞群体在本研究使用的各种共刺激通路阻断方案中以及治疗停止后随后移植物排斥的关联中，显示出相似的调节模式。CD8⁺ T细胞在移植物衰竭预期中外周血的扩增及其在排斥移植物中的优势支持了活化CD8 T细胞作为介导移植物损伤关键效应细胞的传统范式。数据显示了先前未描述的排斥前后循环嗜酸性粒细胞的扩增，支持了可检验的假设，即预防嗜酸性粒细胞扩增或干扰其功能可能解决一种共刺激通路抵抗的同种异体移植物损伤机制。排斥移植物内CD4⁺CD8⁺（DP）T细胞和IgD^?CD27^?（DN）B淋巴细胞的突出也提示这些细胞亚群参与致病性同种免疫反应，这一假设值得进一步研究。GILs中T Foxp3⁺亚群相对于PB的变化，特别是排斥时特定簇中细胞数量的增加，可能提示这些细胞在揭示排斥免疫机制中的重要作用。基于这项初步调查，得出结论：未来在更大动物群体中，使用一致治疗方案，努力阐明特定PB、LN和GIL细胞亚群的作用，是识别预防同种异体移植排斥和促进耐受的新候选方法的有前景策略。