唾液代谢组学分析揭示2-氨基烟酸和可可碱作为乳腺癌非侵入性生物标志物的潜力

本研究通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）非靶向代谢组学技术，系统分析了乳腺癌（BC）患者与正常对照（NC）的唾液代谢谱，鉴定出101种差异代谢物（81种上调，20种下调）。研究首次验证唾液中的2-氨基烟酸（AUC: 0.81）和可可碱（AUC: 0.75）可作为乳腺癌筛查的高潜力非侵入性生物标志物，并揭示咖啡因代谢、鞘脂代谢等关键通路在乳腺癌代谢重编程中的重要作用。

　　

1 引言

乳腺癌（BC）作为全球女性发病率与死亡率最高的恶性肿瘤，2020年新发病例超过230万，死亡病例约68.5万，对女性健康构成严重威胁。目前临床诊断主要依赖乳腺X线摄影、超声、磁共振成像（MRI）等影像学检查以及组织活检等侵入性手段，这些方法在早期筛查的便捷性和非侵入性方面存在局限。唾液作为一种富含代谢物的非侵入性生物样本，其采集简便、重现性高，能有效反映机体的生理病理变化。近年来代谢组学技术在癌症研究中展现出显著优势，尤其是液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）非靶向代谢组学在生物标志物发现领域具有巨大潜力。已有研究通过毛细管电泳-质谱（CE-MS）技术在唾液中发现14种氨基酸作为乳腺癌潜在标志物，且在口腔癌、胰腺癌、肺癌等疾病诊断中取得进展。然而唾液代谢组学在乳腺癌中的应用仍较有限，其代谢特征与机制尚未系统阐明。

2 材料与方法

2.1 临床样本与伦理批准

研究纳入湖南省肿瘤医院2024年12月至2025年8月期间的受试者。筛查集包含30例BC患者与20例正常对照（NC），验证集通过MedCalc软件基于筛查集AUC值（α=0.05, β=0.2）计算得出52例BC与52例NC。所有参与者均签署知情同意书，研究经医院伦理委员会批准（2025-KY-KS-045）。

2.2 唾液采集与处理

样本采集前一周禁食咖啡、巧克力等含可可成分食物，采集前一小时禁食禁饮。采用自然吐唾法收集唾液样本，经4°C、2600g离心15分钟后取上清液，液氮速冻后存于-80°C超低温冰箱。

2.3 代谢物提取与仪器分析

使用Starlid?自动化工作站进行代谢物提取，采用甲醇:乙腈=1:1（含同位素内标）的提取溶剂。超高效液相色谱（UHPLC）系统配备Waters ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱进行分离，Orbitrap Exploris 120质谱仪在全扫描和二级扫描模式下采集数据。质谱参数：鞘气流速50 Arb，毛细管温度320°C，正离子模式喷雾电压3.8kV。

2.4 酶联免疫吸附测定（ELISA）

使用Cloud-Clone公司ELISA试剂盒检测唾液中的2-氨基烟酸和可可碱。样本经PBS稀释后加入预包被抗体板，经孵育、洗涤、显色等步骤，在450nm波长下测定吸光度。

2.5 数据分析

采用R语言进行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），以变量重要性投影（VIP）>1且p<0.05作为差异代谢物筛选标准。通过KEGG数据库进行通路注释与富集分析，并采用受试者工作特征（ROC）曲线评估诊断效能。

3 结果

3.1 主成分分析

PCA显示质量控制（QC）样本聚类良好，数据稳定性高。OPLS-DA模型参数R2X=0.312，R2Y=0.617，Q2=0.251，两组样本呈现明显分离趋势。共鉴定101种差异代谢物，其中上调81种，下调20种。最显著上调代谢物包括2-氨基烟酸、N-乙酰-D-半乳糖胺-4-硫酸酯等，最显著下调代谢物包括茶碱、1,7-二甲基黄嘌呤等。相关性分析显示2-甲基-3-羟基丁酸与2-甲基丁酸呈强正相关（相关系数近1），而茶碱与咖啡因代谢呈负相关。

3.2 通路分析

KEGG富集分析显示差异代谢物主要富集于其他次生代谢物生物合成、癌症概述及碳水化合物代谢通路。矩形树图显示咖啡因代谢、鞘脂代谢和丙酸代谢通路贡献度最高。气泡图显示咖啡因代谢和胆碱代谢的富集因子（Rich Factor）较高且具有统计学显著性（p<0.05）。

3.3 ROC曲线分析

在筛查集中，上调代谢物中2-氨基烟酸的AUC值最高，下调代谢物中可可碱的AUC值最显著。在验证集中，ELISA验证显示可可碱的AUC为0.81（95%CI: 0.72-0.88）， cutoff值5.88ng/mL，灵敏度96.15%，特异度59.62%；2-氨基烟酸AUC为0.75（95%CI: 0.66-0.83），cutoff值5.27ng/mL，灵敏度73.08%，特异度69.23%。箱形图与散点图均显示两组间浓度分布存在显著差异。

4 讨论

本研究首次通过唾液代谢组学发现可可碱（咖啡因代谢关键中间体）和2-氨基烟酸（烟酸代谢衍生物）在乳腺癌诊断中的价值。可可碱水平下降可能与乳腺癌患者细胞色素P450酶（尤其是CYP1A2）活性抑制有关，2-氨基烟酸升高可能反映烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）代谢紊乱。通路分析提示咖啡因代谢、鞘脂代谢和丙酸代谢在乳腺癌代谢重编程中发挥重要作用：咖啡因代谢可通过调控PI3K/AKT/mTOR和AMPK信号通路影响肿瘤细胞增殖与自噬；鞘脂代谢异常与鞘氨醇-1-磷酸（S1P）介导的肿瘤侵袭转移密切相关；丙酸代谢障碍则反映短链脂肪酸代谢失衡与线粒体功能异常。

研究的创新性在于首次系统验证唾液代谢组学在乳腺癌非侵入性诊断中的应用价值，2-氨基烟酸和可可碱的组合检测为早期筛查提供新思路。局限性包括样本量较小、未进行分子机制验证、未区分乳腺癌亚型。未来需开展多中心大样本验证，结合多组学技术与功能实验深入探索代谢物在乳腺癌发生发展中的机制作用。