LAG-3+调节性T细胞通过抑制效应功能并允许其增殖为新一代Treg细胞来维持抗原特异性免疫耐受的机制研究

本研究发现LAG-3+适应性调节性T细胞（aTreg）在体内可抑制初始抗原特异性CD4+ T细胞的效应功能，但允许其增殖。被抑制的T细胞通过代谢重编程（转向无氧糖酵解）和PD-1/PD-L1信号通路上调，获得LAG-3表达并转化为新一代抑制性T细胞，形成"传染性耐受"。该机制为癌症免疫治疗和自身免疫病干预提供了新靶点。

　　

1 Introduction

免疫耐受是指免疫系统对特定抗原不反应的状态。自身反应性T细胞在胸腺成熟过程中通过阴性选择被清除，但也可能发育为调节性T（Treg）细胞。成熟T细胞在外周也可被诱导为适应性Treg细胞（aTreg），维持对肿瘤或慢性感染抗原的耐受。抑制性受体（免疫检查点）如CTLA-4、PD-1或LAG-3在Treg细胞表面的结合对其功能至关重要。靶向免疫检查点的单克隆抗体可逆转aTreg介导的免疫耐受，已成功用于肿瘤治疗。

研究者利用流感血凝素（HA）抗原特异性转基因小鼠实验系统，发现初始HA特异性CD4⁺ T细胞在C3-HA转基因小鼠中对自身HA抗原产生应答，经过短暂效应期后最终发育为LAG-3⁺ aTreg细胞。本研究证明，在受体C3-HA小鼠中，第二次转移的初始T细胞在LAG-3⁺ aTreg细胞的抑制下虽然丧失效应功能但仍能增殖，并获得LAG-3表达，在体内成熟为下一代LAG-3⁺ aTreg细胞。

2 Results

2.1 LAG-3⁺ aTreg Cells Suppress Effector Function of T Cells and Allow Their Proliferation In Vivo

在抑制性C3-HA转基因小鼠中进行第二次细胞转移后，脾细胞在认知HA肽刺激下第2天分泌少量IFN-γ，第3和第4天无IFN-γ分泌。而非抑制性小鼠的脾细胞在第2和第3天分泌较高量IFN-γ。ELISPOT assay显示被抑制的第二次转移细胞在第2至4天不产生IFN-γ。

被抑制细胞和aTreg细胞的Th1、Th2和Th17转录因子（T-bet、GATA3、ROR-γt）及细胞因子（IFN-γ、IL-4、IL-17）mRNA水平相当，但与初始对照相比无显著升高。效应T细胞呈现Th1主导特征，T-bet和IFN-γ上调。

组织病理学显示，抑制性小鼠（有Tregs）肺切片中淋巴细胞和红细胞浸润肺泡空间，浸润物仅聚集在血管一侧；而非抑制性小鼠（无Tregs）肺泡间隔广泛损伤，血管周围出现晕轮状管周浸润和肉芽肿样病变。

尽管效应功能被沉默，被抑制细胞在体内随时间推移显著增殖。第3和4天，抑制性和非抑制性C3-HA小鼠肺中过继转移的6.5 CD4⁺ T细胞百分比相当。使用Thy1.1⁺/1.1⁺细胞进行第二次转移，被抑制的Thy1.1⁺/1.1⁺ 6.5 CD4⁺ T细胞在抑制性小鼠肺中的百分比从第2天的0.13增加到第3天的1.75和第4天的2.40。CFSE-based细胞分裂实验验证了被抑制细胞的持续增殖，尽管速度较非抑制细胞慢。

2.2 Anaerobic Glycolysis With Up-Regulated PD-1 and Down-Regulated Inflammatory Pathways of the Suppressed CD4⁺ T Cells

转录组分析显示，被抑制细胞中T细胞受体信号通路以及PD-L1和PD-1检查点通路上调，与抗原结合相关的基因和多种炎症信号通路（尤其与神经炎症、神经退行性疾病和自身免疫 disorders相关）下调。

CD4、RELA、IRF4、ITGB1和PD1是>6倍上调基因中的关键基因；MYC、TAF1和HNF4A是>6倍下调基因中的关键基因。上游信号级联中PPP3C、IL4R、CD3D、IFNGR2和MHC2基因的下调与IFN-γ、IL-4和IL-17细胞因子的抑制相关。

被抑制细胞中负责线粒体呼吸链复合体-I有效组装（NADH:泛醌氧化还原酶A2、A13、B7、C2和S4亚基）的基因下调，表明氧化代谢抑制。HIF1a（HIF-1α）、LDHA、PFKL和PGK1的上调也提示无氧糖酵解是被抑制细胞的主要能量来源。这种向无氧糖酵解的转变与调节性细胞因子TGF-β、IL-10和IL-35的上调无关。

2.3 The Suppressed CD4⁺ T Cells Acquire LAG-3 Expression With Proliferation

被抑制细胞保留了增殖和IL-2分泌能力。从抑制性和非抑制性C3-HA小鼠分别分选第2和3天的细胞后，在体外经认知HA肽进一步刺激，被抑制细胞比非抑制细胞增殖和分泌IL-2更显著。第4天分选后，只有被抑制细胞分泌IL-2，但两者再刺激后均不增殖。

细胞内染色显示，被抑制细胞再刺激后产生IL-2，但不产生炎症细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-17，也不产生调节性细胞因子IL-10。尽管有SMAD2/3磷酸化，它们未能激活TGF-β。

到第4天，它们表面表达显著高的LAG-3和 marginally高的CD25和CTLA4。CD25和GITR表面表达及核内Foxp-3表达保持在初始细胞的基础水平。它们的LAG-3表达水平与第一次转移细胞相当。大多数Foxp-3⁺和更多Foxp-3^Neg被抑制细胞表面有LAG-3表达。

2.4 Suppressed CD4⁺ T Cells Become Next-Generation LAG-3⁺ Regulatory T Cells In Vivo

从抑制性C3-HA转基因小鼠第4天脾细胞分选"被抑制的Thy1.1⁺ 6.5 CD4⁺ T细胞"，与Thy1.2⁺野生型小鼠的初始脾细胞在抗CD3、抗CD28、IL-12和IL-18刺激下共培养72小时。添加的被抑制细胞抑制了Thy1.2⁺ CD4⁺ T细胞的T-bet诱导、STAT1磷酸化和IFN-γ分泌。

将分选的"被抑制的Thy1.1⁺ 6.5 CD4⁺ T细胞"与2.5×10⁶初始6.5 CD4⁺ T细胞共同过继转移至初始C3-HA小鼠。被抑制细胞与初始6.5 CD4⁺ T细胞比例为0.33:1时，所有受体小鼠存活；比例为0.17:1时，所有受体小鼠在第8天死亡；无被抑制细胞时，转移2.5×10⁶初始6.5 CD4⁺ T细胞导致所有受体小鼠在第5天死亡。表明被抑制细胞获得LAG-3表达，自身成为下一代aTreg细胞。

3 Discussion

LAG-3作为Treg标志物，在急性/慢性病毒感染、细菌感染、寄生虫感染、自身免疫和癌症中具有调节功能。LAG-3⁺、CTLA4⁺和PD-1⁺ aTreg细胞在体外抑制效应T细胞的增殖和功能，在体内抑制Treg细胞的增殖和功能。

本研究发现在流感病毒感染中，Foxp3⁺ nTreg细胞抑制认知抗原特异性CD8⁺ T细胞的增殖，而LAG-3⁺ aTreg细胞不抑制其增殖。效应功能被解除的抑制细胞的增殖允许在LAG-3抑制下从激活到记忆形成的安全过渡。在耐受性C3-HA转基因小鼠中，效应功能被解除的抑制细胞的增殖导致在LAG-3抑制下从激活到下一代aTreg细胞的安全过渡。这种差异可能由流感病毒感染中抗原负荷随时间减弱与C3-HA转基因小鼠中稳定抗原负荷所驱动。

LAG-3抑制导致被抑制细胞中与抗原结合相关基因的下调，抗原结合减少可能导致抗原驱动反应力不足，未能诱导Th1、Th2和Th17机制。上游信号级联中PPP3C、IL4R、CD3D、IFNGR2和MHC2基因的下调证明了这种缺陷。RELA而非NFKB1的上调也提示NF-κβ复合物激活不完全。然而，并非所有信号级联停止，这种不充分的激活力足以维持IL-2分泌和增殖的信号级联。与此同时，Treg细胞的IRF4、ITGB1和PD1网络被诱导。

激活T细胞的主要代谢适应是葡萄糖代谢增加，包括有氧糖酵解（促进氧化磷酸化OXPHOS）。Foxp-3⁺ nTreg细胞已知抑制糖酵解。被抑制细胞中MYC、TAF1和HNF4A的下调与T细胞糖酵解减少一致。负责线粒体呼吸链复合体-I有效组装的基因下调表明氧化代谢抑制。此外，上调的HIF1a（HIF-1α）、LDHA、PFKL和PGK1提示无氧糖酵解是被抑制细胞的主要能量来源。

"传染性耐受"指耐受从一个淋巴细胞群体转移到另一个群体。本研究在抗原特异性实验系统中证明了类似的传染性耐受：初始细胞首先发育为LAG-3⁺ aTreg细胞，这些细胞抑制初始细胞的效应功能但不抑制其增殖。被抑制细胞随着增殖获得LAG-3表达和调节功能，成为下一代LAG-3⁺ aTreg细胞，能够在体外和体内抑制。基因组数据集中，LAG-3⁺ Treg细胞与TGF-β、IL-10和IL-35细胞因子的上调无关，这些细胞因子的基因和蛋白质在被抑制细胞中也未扩增。它们不负责耐受从LAG-3⁺ aTreg细胞向它们抑制的初始认知抗原特异性CD4⁺ T细胞的转移，而是不完全的NF-κβ复合物与增殖和效应反应解耦联相关。

基因表达谱的综合分子分析显示，被抑制细胞代谢维度从氧化代谢向无氧糖酵转变。这种转变促进了在传染性耐受期间向下