G6PD的表观遗传调控驱动肝内胆管癌代谢重编程与化疗增敏的新机制

本文揭示了肝内胆管癌（ICC）中肿瘤特异性增强子通过表观遗传调控G6PD（葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）表达，激活磷酸戊糖途径（PPP）维持氧化还原稳态（NADPH/NADP+）和化疗耐药的关键机制，为靶向代谢表观调控联合 cisplatin 治疗提供新策略。

　　

引言

肝内胆管癌（ICC）作为高度恶性的原发性肝脏肿瘤，具有预后差、分子异质性高和化疗耐药等特点。代谢重编程是ICC进展的重要特征，其中磷酸戊糖途径（PPP）通过提供核苷酸合成前体和NADPH还原力，在维持氧化还原稳态中发挥核心作用。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）是PPP的限速酶，但其在ICC中的调控机制和功能尚未明确。本研究通过多组学分析和功能验证，揭示了肿瘤特异性增强子通过表观遗传机制调控G6PD表达，驱动ICC代谢重编程的新机制。

材料与方法

研究利用11例ICC患者的88个样本进行全转录组测序，10例患者的49个样本进行蛋白质组和代谢组分析。通过NET-CAGE技术（native elongating transcript–cap analysis of gene expression）鉴定肿瘤特异性增强子，使用scRNA-seq和scMetabolism分析单细胞代谢活性。采用dCas9-KRAB系统进行增强子敲低，通过MTT、克隆形成实验评估细胞增殖，利用小鼠皮下成瘤模型验证体内功能。G6PD酶活性、NADPH/NADP⁺比值和ROS水平分别采用比色法、WST法和DCFH-DA荧光法检测。

肿瘤特异性增强子的鉴定与特征

NET-CAGE分析在4个ICC细胞系（HuH28、HCCC9810、SSP25、RBE）和正常胆管上皮细胞（IHBEC）中鉴定出18,866个肿瘤特异性增强子，而正常细胞仅803个（表1）。增强子表现出细胞类型特异性转录活性，且与常规增强子鉴定方法结果高度重叠。通路富集分析显示，肿瘤特异性增强子的靶基因显著富集于葡萄糖-6-磷酸（G6P）代谢和NADP⁺相关通路（图1D），提示PPP代谢在ICC中的关键作用。

单细胞代谢图谱揭示PPP通路激活

从33,991个单细胞中鉴定出10种细胞类型（图2B），发现32条KEGG代谢通路在肿瘤细胞中特异性富集，其中PPP和谷胱甘肽代谢通路在肿瘤上皮细胞中激活最为显著（图2C）。提取的120个高表达基因中，G6PD在肿瘤上皮细胞中表达最高（图2D），TCGA数据和免疫组化验证其mRNA和蛋白在ICC组织中显著上调（图2E），且核定位提示其可能参与染色质重塑。高G6PD表达组显著富集 glutathione代谢、PPP和细胞应激响应通路（图2F）。

多组学验证PPP通路的代谢重编程

多区域采样数据显示G6PD（氧化分支）和TKT（非氧化分支）在转录组和蛋白质组水平均显著上调（图3B-C）。代谢组分析显示肿瘤组织中NADPH/NADP⁺比值显著升高（图3D），且G6PD表达与G6P水平和NADPH/NADP⁺比值呈正相关（图3E），证实G6PD通过PPP调节氧化还原平衡。

G6PD促进肿瘤增殖与不良预后

过表达G6PD显著增强ICC细胞增殖（MTT assay）和克隆形成能力（图4C-D）。生存分析显示高G6PD表达患者总生存期显著缩短（图4E），表明G6PD是ICC的独立预后因子和治疗靶点。

增强子介导的G6PD表观遗传调控机制

机制研究表明G6PD表达罕受突变、启动子甲基化或拷贝数变异影响（图S5）。NET-CAGE鉴定的增强子与ChIP-seq和ATAC-seq数据重叠（图S6），Hi-C证实其与G6PD启动子物理互作（图S7A）。dCas9-KRAB靶向该区域（图5A）显著降低G6PD和相邻基因IKBKG的表达（图5B、S7B），提示其作为共享调控枢纽。 motif分析显示该区域富含NRF2结合位点（图S7C），ChIP-seq证实NRF2和H3K27ac在此富集（图S7A），表明NRF2激活该增强子。

增强子 knockdown 的功能后果

增强子敲低细胞中PPP通路基因显著下调（图5C），细胞增殖和克隆形成能力减弱（图5D-E），小鼠成瘤实验显示肿瘤生长显著抑制（图5F）。G6PD酶活性降低（图6A），ROS水平升高（图6B），NADPH/NADP⁺比值下降（图6C），表明增强子通过调控G6PD破坏氧化还原稳态。

G6PD调控化疗敏感性的治疗意义

G6PD过表达细胞对cisplatin耐药性增强（图6D），而增强子敲低细胞敏感性升高（图6E）。G6PD抑制剂6-AN（6-aminonicotinamide）显著抑制细胞增殖（图6F）并增强cisplatin疗效（图6G），证明靶向G6PD可克服ICC化疗耐药。

讨论与展望

本研究首次揭示ICC中肿瘤特异性增强子通过NRF2依赖的表观遗传机制激活G6PD表达，驱动PPP通流量、维持NADPH依赖的氧化还原稳态和化疗耐药。与传统BET抑制剂相比，靶向特异性增强子可能提供更精确的治疗策略。G6PD核定位提示其可能参与DNA修复，拓展了代谢酶的非经典功能。未来研究需探索增强子谱在精准医疗中的应用和靶向策略的临床转化。

作者贡献与致谢

中川优介负责概念化与数据分析，田中美和指导实验设计，坂本武治提供技术支持，桥本正弘完成主要实验与可视化。研究得到大分癌症研究基金会和AMED资助，超级计算资源由东京大学人类基因组中心提供。