HPV疫苗佐剂安全性研究：比较细胞因子与组织学分析揭示佐剂无致病性

本综述通过对比研究HPV（人乳头瘤病毒）疫苗与其他病毒疫苗的细胞因子（如IFN-β、IL-18）和组织学变化，系统评估了佐剂（如AS04、AHS、AS01）的安全性。研究证实，铝（Al）佐剂仅引起注射部位巨噬细胞积聚（“疫苗纹身”），未导致全身性免疫病理或神经系统损伤；AS01中的QS-21成分可诱导短暂体重下降（与IL-18相关），但MPL佐剂安全性良好。结果为HPV疫苗安全性提供了关键科学证据，有力驳斥了“佐剂致病”假说。

　　

1 引言

高危型人乳头瘤病毒（HPV）的持续感染可导致宫颈癌，其中HPV16和HPV18亚型占宫颈癌病例的70%。针对高危HPV类型的疫苗能有效降低宫颈癌及其他HPV相关癌症的发病率。目前有三种HPV疫苗：二价HPV疫苗（2vHPV）、四价HPV疫苗（4vHPV）和九价HPV疫苗（9vHPV），均通过肌肉注射接种。这些疫苗以HPV主要衣壳L1蛋白为抗原，并含铝（Al）佐剂，包括氢氧化铝（AH）和羟基磷酸铝（AHS）。2vHPV的佐剂为AS04（由AH和单磷酰脂质A（MPL）组成），而4vHPV和9vHPV则使用AHS。

尽管HPV疫苗在全球范围内被证明安全有效，但日本的反疫苗活动家声称2vHPV和4vHPV可能引发一种新型免疫介导的神经系统疾病——“HPV疫苗相关神经免疫病理综合征（HANS）”，导致日本HPV疫苗接种覆盖率低于30%。HANS的发病机制被解释为HPV疫苗接种后引发巨噬细胞肌筋膜炎（MMF），即AH佐剂导致接种肌肉局部铝负载巨噬细胞积聚，进而通过未知机制引发远程器官（包括中枢神经系统）的免疫介导疾病。但这一假说存在缺陷，因为日本其他含AH佐剂的疫苗未报告类似不良反应，且4vHPV并不含AH。

本研究通过给小鼠注射2vHPV-AS04（Cervarix）、4vHPV-AHS（Gardasil）、两种含AH或AHS的乙肝病毒（HBV）疫苗（Bimmugen和Heptavax-II）以及含非铝佐剂AS01（由MPL和QS-21组成）的水痘-带状疱疹病毒（VZV）疫苗（Shingrix），旨在验证HPV疫苗的安全性，并否定MMF作为HANS的病因。

2 材料与方法

2.1 动物实验

使用5周龄C57BL/6小鼠或IL-18受体缺陷小鼠（IL-18RKO），在右股四头肌注射50μL各疫苗或磷酸盐缓冲液（PBS），分别在0、28和56天注射三次。监测体重和神经症状（如运动麻痹、共济失调和翻正反射受损），采用实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）和Theiler鼠脑脊髓炎病毒诱导的脱髓鞘疾病（TMEV-IDD）模型的神经评分系统。在野生型（WT）雄性小鼠中，于56-70天使用代谢笼评估食物和水量摄入，并将第三次注射推迟至63天。

2.2 组织学分析

12周观察期后，取股四头肌、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肠道、大脑和脊髓的石蜡切片。普通器官切片用苏木精-伊红（H&E）染色，中枢神经系统（CNS）切片用卢克索固蓝染色评估神经病理。通过lumogallion染色可视化铝，免疫组化检测F4/80⁺巨噬细胞和CD3⁺ T细胞。

2.3 抗HPV16 L1抗体ELISA

稀释标准HPV16 L1单克隆IgG抗体和小鼠血清，加入包被重组HPV16 L1蛋白的96孔板，使用HRP标记的抗小鼠IgG（H+L）和TMB底物检测，测量450nm吸光度。

2.4 细胞因子微球阵列

在1、14、29、42、57和84天收集血清，使用LEGENDplex小鼠炎症面板（13重）和M1巨噬细胞面板（8重）定量细胞因子，通过流式细胞术和分析软件 suite 分析浓度。

2.5 统计学分析

使用OriginPro 2025进行统计分析，两组比较采用Student t检验，多组比较采用方差分析（ANOVA）和Fisher's LSD事后检验。

3 结果

3.1 疫苗接种后无神经症状但vVZV-AS01组出现体重下降

小鼠接种2vHPV-AS04、4vHPV-AHS、vHBV-AH、vHBV-AHS、vVZV-AS01或PBS后，未出现神经症状，但vVZV-AS01组每次注射后3-4天内体重显著下降，1天后最严重，1周内恢复。

3.2 含铝佐剂疫苗组的肌肉巨噬细胞积聚

四种含铝佐剂疫苗注射部位出现局灶性细胞浸润，主要为F4/80⁺巨噬细胞，伴CD3⁺ T细胞和中性粒细胞，仅邻近巨噬细胞积聚处见小型圆肌纤维（提示肌损伤）。2vHPV-AS04组浸润中心多见胞浆丰富的泡沫样巨噬细胞，vHBV-AH组含胆固醇晶体和巨噬细胞，两组巨噬细胞胞浆内见铝阳性物质；4vHPV-AHS和vHBV-AHS组见细胞外铝阳性无定形物质被巨噬细胞包围。vVZV-AS01和PBS组肌肉组织学正常。对侧股四头肌及心脏、肝脏、肾脏均无异常，大脑和脊髓也无神经病理变化。

3.3 细胞因子谱与病毒抗原或佐剂无关

仅在2vHPV-AS04和4vHPV-AHS组检测到抗HPV L1抗体。13种细胞因子分析显示，所有组中IFN-β、IL-10、IL-27和GM-CSF随时间升高，4vHPV-AHS组细胞因子水平最高。vVZV-AS01组每次注射后暂时性升高IFN-γ、CCL2/MCP-1和IL-6，与体重下降相关。

3.4 vVZV-AS01组体重下降与IL-18相关

vVZV-AS01组血清CXCL1/KC和IL-18每次注射后诱导升高。IL-18与肥胖相关，可能抑制食欲、促进能量消耗。使用IL-18RKO小鼠发现，vVZV-AS01注射后体重下降较WT小鼠轻，且存在性别差异：雌性IL-18RKO小鼠每次注射后仍体重下降，雄性仅第一次注射后下降。IL-18RKO小鼠组成性产生IL-18，且CXCL1/KC和IL-6水平低于WT小鼠。

3.5 佐剂AS01而非抗原诱导暂时体重下降

vVZV-AS01含VZV糖蛋白E抗原和佐剂AS01（QS-21和MPL）。为明确体重下降原因，使用含半量AS01（AS01_E）的RS病毒疫苗（vRSV-AS01_E）及单独AS01溶液注射小鼠。所有组每次注射后均出现暂时体重下降，但AS01组（vVZV-AS01和单独AS01）体重下降较AS01_E组更显著，表明QS-21（而非MPL）是体重下降的主因。

4 讨论

本研究证实，四种含铝佐剂疫苗（包括两种vHPV）未诱导免疫介导的组织损伤或神经异常。注射部位铝负载巨噬细胞积聚伴最小肌纤维损伤，与人类MMF病例相似，但属“疫苗纹身”的生理反应，而非新疾病实体。细胞因子分析显示，含铝佐剂疫苗接种后固有免疫相关细胞因子（如IFN-β）持续升高，或与训练免疫（固有免疫记忆）相关，可能增强对无关病原体的防护。

vVZV-AS01注射后体重下降与IL-18诱导相关，IL-18可能通过抑制食欲和促进能量消耗导致体重减轻。AS01中的QS-21成分激活NLRP3炎症小体，释放IL-1β和IL-18，驱动免疫反应。尽管小鼠中见体重下降，但人类接种vVZV-AS01或vRSV-AS01_E未报告食欲减退或体重下降，可能因物种差异（如代谢率、体型）或症状快速缓解而未察觉。

研究局限性包括小鼠注射剂量高于人体等效剂量，但出于安全性评估目的可接受。结果证实铝佐剂仅引起局部反应，无全身病理效应，且MPL佐剂安全性良好，为HPV疫苗安全性提供了关键科学证据，有助于消除疫苗犹豫，提高接种率，降低宫颈癌负担。