源于香茶菜属的松香烷激活PKC-δ：计算机辅助设计、人血清白蛋白相互作用及稳定性评估揭示其抗结肠癌潜力

本刊推荐：本研究通过计算机辅助设计（in silico）构建了新型松香烷衍生物库，靶向蛋白激酶C-δ（PKC-δ）以开发抗结肠癌疗法。研究揭示了先导化合物7α-乙酰氧基-6β-羟基罗伊兰酮（Roy 1）与人血清白蛋白（HSA）的相互作用机制，证实其具有中等结合亲和力（Ka = 6.5 × 104 M?1）并能显著提升HSA热稳定性（Tm升高4.5°C）。通过分子对接和分子动力学（MD）模拟筛选出最优候选物16（含甘氨酸修饰），其在水相介质（pH 7.4, 37°C）中展现卓越稳定性，为基于罗伊兰酮的靶向治疗提供了创新策略。

　　

1 引言

癌症仍是全球主要健康挑战。蛋白激酶C（PKC）家族在肿瘤发生和转移扩散中起关键作用，其中PKC-δ被广泛表征为促凋亡和抗增殖激酶，但在肺癌、胰腺癌和肝癌等模型中会促进治疗抵抗。人血清白蛋白（HSA）作为一种高效药物载体，具有疏水结合口袋、游离巯基和表面暴露末端等结构特征，适用于多种治疗剂的靶向递送，并能通过受体介导的转运机制促进药物在肿瘤或炎症组织中的积累。

植物是新型生物活性化合物的宝贵来源。香茶菜属（Plectranthus）植物富含松香烷型萜类化合物，具有抗菌、抗肿瘤、抗炎、抗糖尿病和抗氧化等多种生物活性。其中，从大齿香茶菜（P. grandidentatus）中分离得到的松香烷二萜7α-乙酰氧基-6β-羟基罗伊兰酮（Roy 1）对多种癌细胞系表现出显著抗增殖活性，其C6和C12位的羟基可修饰性使其成为药物开发的理想支架。

2 结果与讨论

2.1 PKCδ-C1结构域的分子对接研究

本研究采用分子对接技术筛选靶向PKC-δ的新型罗伊兰酮衍生物。使用与佛波醇-13-乙酸酯（PA）共结晶的PKC-δ-C1结构域（PDB ID:1PTR）作为受体模型，通过FRED、GOLD和AutoDock三种程序比较，FRED在重现PA晶体构象方面表现最佳。基于Roy 1的C6和C12羟基修饰，设计了19种取代基（S1-S19），涵盖简单酰基、脂肪链、芳香苯甲酰基、电子给体/受体、间隔基团、大体积脂肪/芳香族和杂环等类型，以探索与PKC-δ调节域的相互作用。

筛选发现，同时衍生化两个羟基仅有一个化合物（7α,6β-二乙酰氧基-12-O-乙酰罗伊兰酮）效果良好，表明保留至少一个游离羟基可能对结合亲和力重要。独立修饰结果显示，C6位酯化比C12位获得更好对接评分，C6可耐受直链、杂环和苯环等多样取代基（化合物2-8），而C12衍生物则偏好脂肪链或含杂原子芳香环（化合物9-15）。为改善水溶性，在最佳化合物2的C12位引入氨基酸（脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、色氨酸和天冬氨酸），其中甘氨酸衍生物（化合物16）形成四个氢键（与Gly253、Gln257和Met238），预测结合亲和力最强。

2.2 化合物16的分子动力学模拟

通过500 ns显式溶剂无约束MD模拟验证化合物16的结合模式。聚类分析显示94.9%的帧属于最集中簇，其代表结构与PA晶体构象高度相似，直接与Gly253和Gln257形成氢键，并通过水桥与Met239骨架结合。RMSD计算表明PKC-δ/16复合物构象稳定，结合模式可靠。

2.3 HSA与Roy相互作用的荧光分析

在模拟生理条件下研究Roy 1与HSA的相互作用。配体结合导致蛋白质固有荧光浓度依赖性猝灭，发射最大波长从342 nm蓝移至333 nm。通过猝灭数据确定结合常数为6.5 × 10⁴ M^?1（37°C），属于中等强度，与多数结合于HSA亚域II的抗癌药物相当。同步荧光显示Roy 1更接近Trp-214残基，对Tyr残基荧光影响较小。热变性实验表明复合物熔点比单独HSA平均升高4.5°C（8.2%），说明Roy 1结合稳定了HSA结构。结果表明Roy 1与HSA在亚域IIA（Sudlow位点I）结合，提示HSA可作为其系统循环的合适载体蛋白。

2.4 体外抗氧化能力

通过DPPH、ABTS、NO、TAOC、ORAC和HORAC六种方法评估Roy 1的抗氧化能力，并与维生素C和Trolox对比。Roy 1抗氧化能力较低（比标准抗氧化剂弱7-10倍），仅在NO清除实验中与维生素C活性相近。具体数据为：DPPH IC₅₀ >1.5 mM，ABTS IC₅₀ ~1.3 mM，NO IC₅₀ 0.800 mM，TAOC EC₅₀ >2.0 mM，ORAC TE值0.178，HORAC TE值0.142。

2.5 Roy 1在水相介质中的稳定性评价

在PBS（pH 7.4, 37°C）中评估Roy 1的稳定性。由于水溶性差，使用乙腈（ACN, 17%）或DMSO（10%）作为共溶剂。HPLC-DAD检测（270 nm）显示，0.1 mM浓度下40天内无降解；0.4 mM浓度下第2天即出现峰减少，尤其在PBS/DMSO中更明显，但无新峰出现，表明损失由沉淀而非分解引起。沉淀重溶解后确认仅为Roy 1。两种酯衍生物RoyBz（7α-乙酰氧基-6β-苯甲酰氧基-12-O-苯甲酰罗伊兰酮）和Roy12Bz（7α-乙酰氧基-6β-羟基-12-O-苯甲酰罗伊兰酮）在相同条件下也保持稳定，未检测到酯水解。结果表明Roy 1在测试范围内（0.1–0.4 mM）化学稳定，沉淀倾向由低溶解度造成。

3 结论

本研究通过计算机辅助设计针对PKC-δ的新型罗伊兰酮衍生物，发现C12位脂肪族取代和C6位多样官能团修饰有助激活PKC-δ，化合物16为最有前景候选物。Roy 1与HSA结合显示中等亲和力，主要位点近Trp-214，且增强HSA热稳定性。稳定性实验证实Roy 1在pH 7.4和37°C下40天内完全稳定，酯衍生物亦无水解，支持其作为稳定先导化合物开发靶向疗法的潜力。

4 实验部分

4.1 通用方法

HSA（Sigma-Aldrich A1887）浓度用ε₂₈₀ = 35 700 M^?1 cm^?1测定。Roy 1溶于DMSO，HSA测量在50 mM磷酸缓冲液（pH 7.4）中进行，DMSO终浓度不超过1%。

4.2 植物材料

大齿香茶菜栽培于里斯本Tapada da Ajuda植物园，凭证标本保存于ISA标本馆。

4.3 提取与分离

参考Isca等人方法：茎叶干燥粉碎后丙酮超声提取，硅胶干柱色谱分离（Hex:AcOEt和AcOEt:MeOH梯度洗脱），Roy 1通过Hex重结晶获得。

4.4 PKC-δ理论衍生物的分子对接

使用1PTR.pdb晶体结构，FRED软件进行对接，结合口袋依据Bessa等定义，VIDA绘制结构，PyMol可视化。

4.5 分子动力学模拟

AMBER18软件，ff14SB力场（蛋白）和GAFF（小分子），TIP3P水模型，Cl^-中和电荷。先能量最小化溶剂和溶质，加热至300 K（2 ns），密度平衡（2 ns），最后500 ns生产轨迹。CPPTRAJ分析轨迹。

4.6 荧光光谱测量

FluoroMax-4光谱仪，1 cm光径池，37°C。HSA固定1 μM，Roy 1浓度0–14 μM。内在荧光激发280 nm，发射290–450 nm。同步荧光Δλ = 15 nm（Tyr）和60 nm（Trp）。结合常数通过修正荧光强度计算，热稳定性通过F330/F350比值随温度变化测定，熔点（T_m）为曲线拐点。

4.7 抗氧化能力

六种方法测定：DPPH、ABTS、NO、TAOC、ORAC和HORAC，与Trolox和维生素C对比。IC₅₀或EC₅₀表示活性，ORAC和HORAC结果以Trolox当量（TE）表示。

4.8 Roy水相稳定性评价

Roy 1、RoyBz和Roy12Bz在PBS（pH 7.4）含ACN（17%）或DMSO（10%）中孵育（37°C），HPLC-DAD监测（270 nm）。色谱柱Eclipse XDB-C18，流动相甲醇-乙腈-0.3% TFA水溶液梯度洗脱，流速1 mL/min，柱温29°C。通过校准曲线定量。