基于模型的体外转录补料分批优化策略：提升RNA产量与5'端加帽效率的新途径

本文针对RNA疫苗和 therapeutics 生产中的关键环节——体外转录（IVT）反应，首次开发了用于补料分批IVT的机理模型。该模型整合了酶动力学与溶液热力学，成功揭示了反应速率下降的根源（如盐积累、pH降低），并据此优化了加料策略，使敏感序列的RNA产量提升一倍。研究还首次发现并通过热力学建模解决了IVT过程中磷酸镁结晶问题，并将共转录加帽（co-transcriptional capping）模型融入优化框架，实现了在控制加帽率（CF>90%）的同时最大化RNA产出并减少昂贵帽类似物（cap analog）的消耗，为降低mRNA合成成本、保证关键质量属性提供了创新性解决方案。

　　

摘要

近年来，RNA疫苗和疗法的快速发展对RNA合成的关键工艺——体外转录（IVT）提出了更高的过程工程优化需求。目标是在最大化RNA产量和5'端加帽效率的同时，尽量减少昂贵试剂的使用。补料分批IVT是实现这些目标的有前景的技术，但仅通过实验手段难以优化。本研究开发了一个补料分批IVT的机理模型，并利用该模型开发了优化的补料分批方案，以在控制核苷三磷酸（NTP）浓度的同时最大化RNA的形成。在一个对盐浓度敏感的模型序列上，该方法产生的RNA量是启发式方法的两倍。此外，研究首次观察并表征了IVT反应过程中磷酸镁晶体的形成，并基于热力学建模开发了策略以防止这种不希望的结晶。最后，将共转录加帽纳入模型优化方法，开发了在保持高水平5'端加帽 incorporation 并最小化帽类似物用量的同时最大化RNA形成的策略。

1 引言

体外转录（IVT）反应是生产日益增多的RNA疫苗和疗法的必要步骤。由于RNA平台的广泛性，提升IVT经济性和产品质量的过程工程策略可能对许多疗法的可及性产生重大影响。IVT是一种基于模板DNA序列的无细胞酶促核苷三磷酸（NTP）单体聚合反应，通常以分批反应进行。IVT工艺开发的一个关键兴趣点是最小化昂贵试剂的使用，同时最大化RNA的形成以及如5'端加帽到RNA产物中等质量属性。5'端加帽是连接到RNA分子5'末端的基团，对于体内的稳定性和功效是必需的。加帽率（CF），即含有5'端加帽的RNA比例，是RNA产物的关键质量属性。在IVT中，通常通过共转录 incorporation 帽类似物来添加这种加帽，帽类似物模拟序列的初始核苷酸同时包含加帽结构。IVT的输入材料可占RNA总生产成本的75%。目前，这些试剂成本大部分来自聚合酶、DNA模板和帽类似物。除了少量被 incorporation 到RNA中的帽类似物外，这些试剂在分批RNA合成过程中不会被消耗。因此，以补料分批模式进行IVT以重复利用这些试剂聚合额外的NTPs的兴趣日益增长。

从分批到补料分批IVT的转变大大增加了过程优化的决策变量数量。除了初始反应条件外，还必须考虑每次试剂补料的时间和量。此外，实践者必须考虑多个目标，包括最大化RNA形成以及控制pH和NTP浓度到期望范围，这会影响如CF等产品质量属性。由于决策变量数量的扩大及其对多个过程输出的相关影响，仅通过实验方法优化补料分批IVT是数据密集型的。早期的实验设计方法探索了有限的操作空间，并且未包括共转录加帽。其他策略依赖于迭代的补料分批实验来开发对反应动力学时间趋势的数据驱动理解。此外，先前在补料分批IVT中的努力使用了反馈控制策略，通过测量pH或NTP浓度来维持反应条件在期望设定点。虽然反馈控制方法减少了决策变量的数量，但其性能仍然依赖于初始条件和设定点的明智选择。此外，离线测量（如NTP定量）的时间延迟会降低设定点跟踪的精度。

基于模型的优化可以有效地管理IVT的多变量输入空间，并平衡成本效益高的RNA生产和RNA产品质量的需求。现有的IVT反应过程模型主要针对分批操作模式，不能用于探索更广泛操作空间的补料分批反应。值得注意的是，反复观察到补料分批IVT反应速率随着反应进行而显著降低，这是经济性能的关键障碍。解决这种反应速率下降的基于模型策略需要对IVT系统中潜在的化学和物理有更好的理解。

本工作重点将补料分批IVT作为一个动态系统进行工程化，目标是在给定DNA、RNA聚合酶和帽类似物输入的情况下最大化RNA产量，同时达到目标CF。我们开发了第一个机理过程模型，描述了补料分批IVT中的关键趋势，如高转化率下反应速率的下降。使用该模型，我们计算了用于跟踪NTP设定点和最大化RNA生产的最佳反应条件，使用的是对盐浓度高度敏感的模型DNA序列。我们在实验设置中证明了这些方法与启发式策略相比的有效性。最后，我们向模型中加入了一个预测CF的表达式，并设计了补料分批策略，以在保持高CF（>90%）的同时最大化每单位帽类似物输入的RNA产出。

2 结果

2.1 补料分批IVT的机理模型

补料分批IVT模型的完整阐述和参数估计策略见支持信息（S4–S5节）。该模型建立在早期出版物中提出的分批模型基础上。简而言之，RNA由RNA聚合酶从DNA模板合成，将NTPs incorporation 到生长链中。该过程包括结合、起始和延伸步骤，并对溶液条件如NTP浓度和必需镁辅因子浓度敏感。该模型合并了描述酶动力学的微分方程组与描述瞬时离子形态的非线性代数方程组。将模型扩展到描述补料分批IVT所需的关键添加涉及盐和pH对反应速率的影响，如下文进一步讨论。

盐，如补料过程中添加的NTPs的反离子，在补料分批反应中可能比在分批反应中浓度更高。早期工作表明IVT速率对盐添加高度敏感。我们的模型通过考虑离子对聚合酶-DNA结合的影响来描述这些盐效应，使用了最近推导的方程。聚合酶-DNA启动子解离的速率常数为（方程1），其中是代表聚合酶-启动子复合物有效结合强度的参数，有效盐浓度为（方程2），其中是代表每个离子复合物对有效盐浓度相对贡献的离子特异性参数，是给定离子复合物的浓度。该方程对系统中所有复合物求和，这些复合物在我们的形态模型中枚举。该模型可以通过捕捉添加氯化钠和乙酸钠对IVT动力学的差异效应来指导试剂的选择。此外，该模型有效地预测了在高镁浓度下实验记录到的反应速率下降，这是由于Mg2?离子对聚合酶-启动子结合的强烈破坏作用。

与分批反应相比，补料分批反应表现出不可忽略的pH动态趋势，这会影响酶性能。由于核酸产物的形成，溶液pH随着反应进行而降低。因为pH的整体下降与合成的RNA总量相对于溶液缓冲能力有关，补料分批反应可能比典型的分批反应经历更大的pH变化，下降超过一个单位。我们的离子形态模型描述了IVT溶液中离子的质子化，用于计算pH随反应进程的变化。为了描述pH对反应速率的影响，速率常数乘以一个无量纲因子，其中（方程3），遵循关于酶pH依赖性的经典文献，其中和是从数据估计的参数。值得注意的是，描述pH对IVT速率影响的实验数据因上述盐效应而复杂化，因为pH是通过添加离子在实验中改变的。我们的整体过程模型对于从这些扭曲的数据中推断IVT的内在pH依赖性至关重要。

我们成功地用大量的分批和补料分批反应的文献数据验证了所开发的IVT模型。该模型准确地描述了补料分批IVT中常见的反应速率下降。该模型将盐的积累、催化剂的稀释和反应pH的下降确定为补料分批IVT中反应速率下降的主要原因。值得注意的是，该模型还可以预测连续补料的补料分批反应的动态趋势，准确地描述了pH的下降、NTP浓度的非明显动态趋势以及反应速率的下降。

2.2 基于模型的设定点跟踪和RNA产量优化

在文献数据验证之后，该模型被用于设计补料分批IVT方案。这些实验是在一个先前被确定对盐特别敏感的DNA构建体上进行的。为了模拟这种增加的盐敏感性，参数根据这些先前数据拟合为增加的值。在本工作建模的所有其他序列的情况下，该参数保持恒定在较低值。我们的初始目标是在给定固定RNA聚合酶和DNA催化剂输入的情况下产生最大量的RNA。此外，我们设定了在反应器操作期间控制NTP浓度和pH的目标，因为将这些溶液条件维持在某些范围内对于RNA产物的纯度和质量是可取的。为此解决的优化问题是（方程4），其中是代表一组初始条件和加料策略的向量。实际上，该加料策略被实现为一组在2-3小时反应操作期间分散进行的9-12次包含NTPs、Mg和NaOH的间歇添加。项和代表给定策略在时间的NTP浓度和pH。项和分别代表设定点NTP浓度和pH，而集合和分别包含评估和的时间点。超参数、和描述了NTP设定点跟踪、pH设定点跟踪和RNA生产对整体目标函数的相对重要性。

使用此目标函数，我们开发了一种优化的补料分批策略，将其与启发式开发的方案进行比较。启发式设计的方法基于初始反应动力学补加NTPs，未能将NTP浓度控制在初始条件5 mM each。此外，这种启发式方案的反应速率迅速下降，并在形成3 μM RNA（4.3 g L?1）后消失。这种行为被模型预测所捕捉。我们的模型表明，将NTP浓度控制到较低的2 mM设定点将有助于防止反应速率下降。除了NTPs的动态补加变化外，我们的优化方法改变了Mg的初始和补加量，并改变了添加到反应中的缓冲液的量和配方。优化方法实现了NTPs在2 mM目标下的设定点跟踪，表明模型正确估计了反应速率随反应进程的趋势。此外，优化的补料分批方案能够产生更大量的RNA，因为反应速率没有像启发式设计的实验中那样快速衰减。在形成7 μM RNA（10 g L?1）后，优化方法保持了初始速率的33%。

我们优化方案增加的产量和反应速率主要是由于有效盐浓度的降低。我们的过程优化在计算最佳补料分批策略时考虑了我们工作中使用的序列的高盐敏感性，其净效果是将有效盐浓度降低了大约100 mM。这一结果验证了我们基于模型的假设，即保持低盐浓度是优化补料分批IVT的关键工具。

2.3 利用基于模型的策略避免磷酸镁沉淀

在开发上述优化策略期间，视觉观察到反应操作过程中固体沉淀的形成，并通过电子显微镜和衍射对其进行了表征。扫描电子显微镜图像显示出结晶材料特有的球状微海绵结构。元素图谱表明这些结构由镁、磷和氧组成，其比例与无水Mg?(PO?)?的分子式一致。单个纳米片的衍射图样与无水磷酸镁多晶型的晶胞匹配。

这一观察结果与模型预测和实验数据之间的不匹配相吻合，表明这种沉淀减慢了IVT反应。发现溶液中镁的最终浓度明显低于预期，表明这种沉淀消耗了反应器中大部分镁。此外，观察到对NTP浓度的模型预测在反应操作大约一小时后与实验测量值出现分歧，暗示模型未捕捉到的某种现象在后期时间点降低了反应速率。假设反应过程中磷酸镁的沉淀对反应速率有负面影响，可能是通过降低溶液中镁的浓度。

为了实施上述演示的优化策略，有必要设计IVT系统，使这种沉淀不会对反应产生实质性影响。使用我们的形态模型，我们尝试设计一种反应策略，以降低磷酸镁沉淀的热力学驱动力。对于该化合物，热力学过饱和度写为（方程5），其中是磷酸镁固体的溶度积。使用我们的过程模型，我们确定了一种在不牺牲反应性能其他方面的情况下降低这种驱动力的策略。由于质子的磷酸盐形式与游离磷酸根离子竞争，降低反应pH被预测会降低过饱和度。我们将最优控制公式从目标在整个反应过程中pH为8.0调整为目标在过程结束时设定点为7.3。此外，略微减少了向反应中补加镁的量以降低游离镁浓度。这些变化在假设没有磷酸镁沉淀的情况下，将最终过饱和度降低了大约25%。这种低pH策略的实验实施表明，镁的沉淀仅在反应后期出现，并且明显少于高pH策略的情况。此外，模型预测和实验NTP浓度之间的不匹配实际上消失了。这表明磷酸镁沉淀是模型-工厂不匹配的主要驱动源。这种低pH策略用于前面部分所示的优化方法。

2.4 共转录加帽的基于模型优化

产物RNA中含有5'端加帽的比例，即IVT的关键质量属性，取决于NTPs和帽类似物之间的竞争。通过动态控制反应过程中NTP的浓度，可以在给定的帽类似物输入下最大化该CF。为了优化此过程，我们开发了一个机理模型来预测CF作为溶液条件的函数。这种准稳态动力学模型描述了三分核苷AG帽类似物与NTP单体之间的竞争。在该模型中，RNA序列的前两个碱基对可以通过ATP和GTP的两步添加或AG帽类似物的一步添加形成。使用该动力学模型，推导出了瞬时加帽率的方程（方程6），其中（方程7），基于图中所示的速率常数。由于量化CF的实验成本高且不精确，需要合理的实验设计来识别这些参数。我们使用D最优准则开发了两个实验分批方案来识别和。该过程使用了一组从先前发表的关于类似化学系统的数据中收集的初始估计值。此优化中的决策变量是初始ATP、GTP和AG帽浓度。直观上，这些分批方案中的第一个使用了高GTP浓度，而第二个使用了非常低的GTP浓度。最大似然估计用于估计参数和分别为25–150 M?1和0.5–20 mM。

使用2 mM的NTP设定点，我们设计了一个补料分批IVT方案，以在保持目标CF至少90%的同时最大化RNA生产。我们的模型表明，目标CF可以通过仅添加2 mM的AG帽类似物来实现。为了验证我们在此体系下的加帽模型，使用2 mM的每种NTP和AG帽类似物进行了分批实验。测得的CF为0.92±0.05，略低于模型预测的0.97±0.02，但不显著。此外，该模型在包括使用AG帽类似物的补料分批反应的文献数据上得到了验证。该验证表明加帽模型通常可用于描述数据趋势，并可用于设计补料分批反应。使用这些设定点，我们开发了一个优化的补料分批方案，预测其产生的RNACF在0.92到0.97之间。与分批操作相比，优化的补料分批实施产生了四倍的RNA，同时保持了相似的CF（0.88±0.05），处于我们目标的实验不确定性范围内。

3 讨论

在RNA制造的背景下，实践者寻求优化IVT反应，以在最小化昂贵试剂使用的同时最大化RNA的生产和CF。虽然补料分批反应是实现这些结果的有前景的工具，但此工程问题的多变量性质使得优化具有挑战性。在本工作中，我们使用机理过程模型来设计和优化补料分批IVT的方案。我们的结果证明了这种机理方法在实现设定点跟踪和提高给定催化剂和帽类似物输入的RNA产出方面的有用性，这些是销售成本的关键驱动因素。

机理方法对于理解和改善补料分批操作中观察到的反应速率下降至关重要。我们的模型包括可能导致这种下降的多种机制，包括催化剂稀释、盐积累和pH下降，并且可以识别这些途径中哪一个是观察到的反应下降的主要贡献者。先前工作已经注意到我们实验中使用的构建体表现出对盐的敏感性增加。启发式补料分批设计方法由于这些盐的积累而表现出反应速率的快速下降。反事实模型模拟表明，如果该构建体表现出较低的盐敏感性，这些启发式方法本可以表现良好，表明考虑IVT构建体的特定动力学特性在补料分批方案的设计中至关重要。

利用我们的机理理解，反应方案在多个方面进行了改变，以降低整体盐浓度和反应系统的盐敏感性。这些变化包括缓冲液组成、NTP设定点、镁浓度以及RNA聚合酶和DNA的相对浓度的修改。降低NTP设定点和镁辅因子浓度约占有效盐浓度总减少量的一半，而用较低浓度的tris碱替代常用的tris-HCl缓冲液占了另一半的减少。虽然先前的研究人员已经尝试通过用tris-乙酸缓冲液替代tris-HCl缓冲液来降低有效盐浓度，但基于模型的方法可以通过预测将反应pH控制到期望窗口所需的最小缓冲液浓度走得更远。我们的优化反应方案以慢得多的速度下降，并产生了比启发式策略多一倍以上的RNA。

我们的优化方法成功地将反应器操作期间的NTP浓度控制在1-2 mM范围内。过去在补料分批IVT的反馈控制努力由于离线测量的时间延迟而难以控制NTP浓度。例如，先前研究的补料分批系统中的NTP浓度在1到8 mM之间变化。系统动态的宽波动会增加依赖于NTP浓度的质量属性（如CF）的批次间差异。在我们的工作中，大部分的NTP波动是由于我们的间歇补料方案。未来使用连续补料的工作可以进一步减少IVT期间的NTP变化。

除了识别最佳反应策略外，我们的机理模型对于理解并克服工艺开发过程中的障碍也至关重要。本工作中开发的形态模型对于理解工艺参数对反应过程中不希望的磷酸镁沉淀的热力学驱动力的影响至关重要。虽然IVT过程中焦磷酸镁的沉淀先前已被观察、表征和建模，但我们使用焦磷酸酶通过将其降解为磷酸盐来防止焦磷酸盐积累。这项研究是研究文献中首次报道IVT过程中发生磷酸镁沉淀。由于这是首次报道这种沉淀在IVT过程中发生，我们无法依赖数据驱动的解决方案来解决这个问题。我们的第一性原理方法使我们能够以最少的实验迭代消除这种沉淀的有害影响。

补料分批IVT最有前景的应用之一是通过动态控制反应过程中的NTP浓度来有效利用帽类似物。使用一组最优选择的批量实验，我们将预测加帽的表达式纳入我们的整体过程模型。这使我们能够预测性地设计补料分批反应，以在保持最终加帽率在期望水平（>90%）的同时，最大化每单位帽类似物输入的RNA产量。这种方法允许实践者在CF和帽类似物消耗的帕累托前沿上操作在期望点。例如，我们的模型还可以准确描述实现更高CF（>95%）同时消耗三倍量AG帽类似物的补料分批反应的结果。在这种情况下，由于NTP和帽浓度的动态变化，CF表现出动态趋势，证明了在预测CF时需要动态过程模型。

比较分析表明，相对于先前工作的关键改进领域在于减少了NTP浓度的动态变化范围，这对于控制如CF等产品质量属性是有用的。此外，反应生产率的综合指标表明，本工作比先前工作略微更有效地使用了聚合酶，我们将其归因于基于模型的整个过程中最佳反应条件（如镁浓度）的控制。由于实践者所面临的确切目标函数可能随时间演变，这种基于模型的方法是一个灵活的平台，用于实现多样化和多变量的目标。虽然本工作侧重于优化单个RNA序列的合成，但这种基于模型的优化工作流程可推广到任何序列。将此方法应用于新序列需要了解该序列的动力学参数，这可以通过一轮有针对性的实验来估计。此外，虽然本工作仅关注CF，但有许多RNA质量属性可以纳入这种基于模型的优化策略，包括双链RNA浓度和短于所需目标序列的RNA的形成。包含这些质量属性需要详细说明这些副产物形成机制和输入输出关系的动力学模型。最后，本工作中提出的模型可以通过添加描述从反应器中连续移除液体的数学项来扩展到描述连续搅拌釜反应器的操作。然而，可能需要添加额外的物理现象，如生物分子催化剂的降解和高RNA浓度引起的粘度，来描述停留时间比本工作中研究的反应时间更长的CSTRs的行为。我们首次开发了一种基于模型的补料分批IVT反应优化方法，该方法能够实现对NTP浓度和CF的动态控制，同时最大化具有不同动力学特性的DNA序列的RNA合成。我们还使用我们的建模方法来控制pH轨迹，这可以在未来的工作中实现对RNA额外质量属性的控制。