甲酸驱动的Cupriavidus necator全细胞催化平台实现Rieske加氧酶高效生物转化

本综述系统阐述了以甲酸（formate）作为碳源和能源驱动重组Cupriavidus necator实现Rieske加氧酶（ROs）催化生物转化的创新策略。研究成功构建了甲酸营养型全细胞催化体系，实现了烯烃类化合物的高效氧官能团化反应（如苯乙烯双羟基化产率达95%），并深入分析了甲酸代谢过程中的细胞应激响应机制。该工作为C1化合物在绿色生物制造中的应用提供了新范式，拓展了非模式微生物在氧化还原酶催化领域的应用潜力。

　　

引言：单碳生物制造的挑战与机遇

随着全球向循环生物经济转型的加速，利用二氧化碳（CO₂）等单碳（C₁）分子成为绿色化学的重要方向。甲酸因其兼具碳源和能源载体特性，且易于储存运输的优势，成为极具潜力的C₁平台化合物。嗜氢贪铜菌（Cupriavidus necator）作为天然的石蜡自养微生物，具备通过卡尔文-本森-巴斯汉（CBB）循环同化甲酸的能力，但其在甲酸营养条件下驱动重组氧化还原酶生物转化的潜力尚未充分挖掘。

甲酸驱动全细胞催化平台的构建

研究团队通过分子工具优化，在C. necator ΔRM菌株中重组表达了两种典型Rieske加氧酶——枯烯双加氧酶（CDO）和萘双加氧酶（NDO）。针对甲酸毒性及培养基碱化等问题，开发了三级连续补料策略：初始适应阶段后，在OD₆₀₀达0.3时启动低流速甲酸供给（8 mmol L^-1 h^-1），当菌密度升至OD₆₀₀ 2.5时提高至43 mmol L^-1 h^-1。该方案使菌体密度在71小时内达到OD₆₀₀=10，并通过延迟诱导表达策略成功实现ROs的可溶性表达。

生物转化效能与机理分析

以茚（1）为模型底物的实验表明，甲酸营养型细胞（HCO₂^--NDO）在甲酸驱动下的转化效率与异养细胞（LB-NDO）果糖供能体系相当，最高转化率>99%。特别值得注意的是，苯乙烯（2）在NDO催化下生成（R）-1-苯基乙烷-1,2-二醇的产率达95%，对映选择性为74% ee。动力学参数显示甲酸体系的比活性（1.6 U g_DCW^-1）虽略低于果糖体系（2.2 U g_DCW^-1），但空间时间产率（35 mg L^-1 h^-1）更具优势。

底物谱拓展研究显示，NDO倾向于催化甲苯（3）和2-硝基甲苯（4）的苄位C-H键氧化，分别生成苯甲醇（3a）和2-硝基苯甲醇（4a）；而CDO则主导芳香环双羟基化反应，生成邻甲苯酚（3b）的产率达74%。在单萜烯转化中，CDO特异性催化（+）-柠檬烯（5）生成反式 carveol（5a）（产率21%），为香芹酮合成提供了绿色路线。

细胞应激响应与形态学表征

透射电镜（TEM）分析揭示，甲酸营养生长的C. necator ΔRM在OD₆₀₀=2.8时仅形成少量聚羟基脂肪酸酯（PHB）颗粒（直径120 nm），至高密度（OD₆₀₀=11.8）时颗粒数量增加且直径增至205 nm，表明后期氮限制引发碳储存。与PHB缺陷株（C. necator PHB-4）相比，野生型菌株能维持正常细胞形态，全基因组测序未发现适应性突变，证实该菌株对甲酸代谢具有天然适应性。

结论与展望

本研究成功构建了甲酸驱动的C. necator全细胞催化平台，实现了ROs介导的高选择性生物转化。该体系不仅拓展了C₁化合物在生物制造中的应用场景，其细胞内PHB原位储能特性更为"碳负排放"工艺开发提供了新思路。未来通过代谢工程优化甲酸同化效率、开发适配的氧化还原酶工具箱，有望推动该平台在医药中间体合成等高附加值产品生产中的工业化应用。