环境DNA(eDNA)技术评估金属污染河流中上游-下游大型无脊椎动物群落的比较研究及其应用潜力

本综述系统探讨了环境DNA(eDNA)技术在金属污染河流生物监测中的应用价值，通过与传统底栖大型无脊椎动物调查方法的对比，揭示了eDNA在上下游比较研究中的优势与局限性（如下游DNA漂移干扰），为发展更精准的水生态系统评估方法提供了重要科学依据。

　　

1 引言

淡水生态系统为人类提供了物质、非物质和调节功能等多重服务。然而，土地利用变化和化学污染等因素导致的生态系统退化与生物多样性丧失，凸显了采取有效保护策略的紧迫性。生物监测对于评估淡水系统的生物与生态健康以及保护措施的有效性至关重要。

在溪流和河流等淡水生态系统中，底栖大型无脊椎动物因其固着性、易于采样以及对环境压力源的多样敏感性，在全球范围内被广泛用作生物指示剂。然而，其分拣和形态学鉴定过程 labor-intensive，需要显微镜下的专家专业知识。

环境DNA（eDNA）技术是一种应对传统生物监测方法所面临挑战的有前途的工具。它允许直接从水等环境介质中分子检测底栖大型无脊椎动物物种，且采样 effort 较低。eDNA的高灵敏度允许进行更全面的多分类群生物多样性评估，并导致比传统生物调查更高的检测丰富度。然而，为了将eDNA作为环境评估中的可靠指标，需要阐明其动态的某些方面。特别是，河流中eDNA的下游运输和扩散，即使没有 substantial 稀释，也会使其准确反映局部生物群落的能力复杂化。eDNA的下游运输据报道可延伸从几百米到超过10公里。基于传统生物监测方法直接收集底栖大型无脊椎动物进行 effluent 排放点的上游-下游比较已被用于环境影响评估和生物评估。eDNA在此类研究中的适用性尚未得到充分测试。

本研究的目标是通过比较eDNA分析与大型无脊椎动物采样的结果，在一条受金属严重污染 tributary 影响的河流中，检验基于eDNA的影响评估潜力。为此，选择了研究地点，其中 tributary 的流入已被报道会 drastically 改变下游底栖大型无脊椎动物群落。这一选择使我们能够确定上游群落的影响在多大程度上会 compromise eDNA基于评估的能力，以辨别在金属污染 tributary 流入下游不同距离处大型无脊椎动物 fauna 的变化。

2 材料与方法

2.1 研究地点

在日本的Waga River（北上川流域）的一条 tributary（Yunosawa River）中选择了一个参考（上游）地点（A1）和四个金属污染地点（A0, A2–A4）。地点A0位于Yunosawa River的一条 tributary 中，接收来自一个关闭矿山（Akaishi矿）的矿山排水。金属污染 tributary 流入Yunosawa River已被报道导致下游金属（如铜和锌）浓度增加，从而引起底栖大型无脊椎动物群落的丰富度和丰度显著减少。为了确定源自上游参考区域底栖大型无脊椎动物的eDNA对基于eDNA评估的影响是否随下游距离而变化，选择了可进入的研究地点，分别位于金属污染 tributary 流入下游约150米（地点A2）、600米（地点A3）和1350米（地点A4）。由于这三个地点的集水面积变化最小（基于Yamazaki et al. 2020，为19–20 km²），我们的结果应主要受eDNA随下游距离衰减的影响，而没有因河流流量增加而稀释的混杂影响。野外采样于2022年5月26–27日进行。

2.2 大型无脊椎动物收集与分析

按照《国家河流环境普查基本调查手册》（NCRE）中描述的定量采样方法收集大型无脊椎动物。具体来说，在每个研究地点随机选择的以卵石为主的急流中的三个位置进行采样，使用25 cm × 25 cm的Surber网（网孔尺寸：0.355 mm），每个地点的总采样面积为1875 cm²。大型无脊椎动物样本在现场用90%乙醇保存在罐子中，并运输到实验室进行分拣和鉴定。对于每个样本，使用网孔尺寸为0.5 mm的筛子分拣出的底栖大型无脊椎动物通常鉴定到种或属水平。

为了基于野外采样检查研究地点之间底栖大型无脊椎动物群落的差异，我们计算了三个主要昆虫目（蜉蝣目Ephemeroptera、毛翅目Trichoptera和双翅目Diptera）的分类单元丰富度（taxon数量）和丰度（个体数量），以及总分类单元丰富度和总丰度。石蝇目（Plecoptera）的分类单元丰富度和丰度没有计算，因为在这些地点它们的丰富度有限（≤ 4个分类单元）且丰度较低（< 20个个体）。此外，计算了 baetid、ephemerid 和 heptageniid 蜉蝣（分别对应Baetidae、Ephemeridae和Heptageniidae科）的丰度。这三个蜉蝣科对金属具有 contrasting 敏感性。在金属污染的河流中观察到金属敏感的ephemerid和heptageniid蜉蝣的丰度减少，但baetid蜉蝣仍然可以在严重金属污染的河流中找到。

2.3 水质测量

水质测量方案遵循先前研究中描述的方法。使用便携式水质计（LAQUAtwin pH-22B和EC-33B, Horiba, Kyoto, Japan）在现场测量pH和电导率。用于溶解痕量金属（Cu、Zn、Cd和Pb）和主要离子（Na、K、Ca、Mg、Cl和SO₄）的抓取水样通过亲水性PTFE过滤器（孔径0.45 μm）过滤，并在现场立即冷藏。在实验室中，向用于痕量金属分析的水样中添加超纯硝酸，并使用电感耦合等离子体质谱仪（Element XR, Thermo Fisher Scientific, MA, US）测定溶解Cu、Zn、Cd和Pb的浓度，遵循美国环境保护署（1994）的方法。使用离子色谱仪（Dionex ICS-1100/2100, Thermo Fisher Scientific）分析主要离子的浓度。

3 eDNA提取、文库制备、生物信息学

3.1 采样

eDNA采样在同一地点和同一天进行，但在大型无脊椎动物和水质调查之前立即进行。在每个地点，从急流末端的河水表层水取三个重复样品。使用一次性无菌50 mL注射器，将1升水通过0.45 μm的Sterivex过滤器（Merk Millipore, MA, US）过滤。过滤器最终被彻底通风和排干，然后注入2 mL RNALater（Thermo Fisher Scientific），并在野外运输期间常温保存在塑料袋中。后来转移到实验室并在-20°C的冰箱中储存。

3.2 分子分析

通过向Sterivex cartridge直接加入720 μL缓冲液ATL和80 μL的20 mg/mL蛋白酶K溶液，并在56°C孵育过夜来提取DNA。用鲁尔锁注射器从cartridge的入口取出液体，并转移到5 mL LoBind管中。随后的提取遵循Spens et al. (2017)的方案，使用DNeasy Blood and Tissue Kit（Qiagen, Hilden, Germany），唯一的偏差是最终用100 μL缓冲液TE进行洗脱，并使用OneStep PCR Inhibitor Removal Kit（Zymo Research, CA, USA）进行纯化。洗脱液在-20°C储存直至进一步处理。

使用线粒体细胞色素c氧化酶亚基I（COI）标记的142 bp片段扩增样品，使用针对大型无脊椎动物——特别是蜉蝣目、襀翅目、毛翅目和双翅目——的通用引物组，使用正向引物fwhF2和反向引物EPTDr2n。该引物对包含一个修饰，引入了Nextera转座酶序列和 shifts，用于两步PCR方法。第一次PCR在10 μL体积中进行，包含三个技术重复，含有1× Multiplex PCR Master Mix（Qiagen Multiplex PCR Plus Kit, Qiagen）和每种引物0.2 μM。然后用无核酸酶水将体积补至10 μL，并加入2 μL DNA模板。第一次PCR遵循Leese et al. (2021)的方法，从95°C初始变性5分钟开始，然后进行10个循环的变性（95°C 30秒）、退火（64°C–54°C 90秒，touch-down PCR）和延伸（72°C 30秒）。随后进行30个循环的PCR，包括初始变性（95°C 30秒）、退火（54°C 90秒）和延伸（72°C 30秒）。最后在68°C进行10分钟最终延伸，并将板冷却至4°C。将第一次PCR产物的三个技术重复合并，并使用AMPure XP（Beckman Coulter, Brea, CA, USA）进行纯化。第二次PCR混合物用1× Multiplex PCR Master Mix、每种带有Illumina适配器序列的Nextera XT index引物0.2 μM和2 μL纯化的第一次PCR产物制备。用无核酸酶水将体积补至10 μL。PCR从95°C初始变性15分钟开始，然后进行10个循环的变性（95°C 30秒）、退火（64°C 90秒）和延伸（72°C 60秒）。最后在72°C进行5分钟最终延伸，并将板冷却至4°C。以与第一次PCR产物相同的方式纯化扩增子，但进行了大小选择以去除剩余的引物和引物二聚体（0.8× SPRIselect; Beckman Coulter）。使用Qubit dsDNA High Sensitivity Kit（Thermo Fisher Scientific）定量PCR产物的浓度，并进行调整和合并，使每个样品具有相等的浓度。使用Tape Station D1000 Screen Tape（Agilent, Santa Clara, CA, USA）测量合并样品的最终扩增子长度。在瑞士苏黎世联邦理工学院基因组多样性中心，按照制造商的说明，使用MiSeq（Illumina）和Reagent Kit v2（300 cycles）以及10%的PhiX spike进行配对末端测序。

3.3 生物信息学

首先使用FastQC检查原始序列数据。整个生物信息学在USEARCH v.11.0.667的环境下进行。去除PhiX、低复杂性 reads 和引物序列（fwhF2/EPTDr2n）。然后将正向和反向reads修剪至100–300个核苷酸，以去除低质量碱基。去除嵌合序列。去除具有歧义或最大预期错误大于2的reads。将解复用的正向和反向reads合并，并使用UNOISE3（USEARCH v.10.0.240）进行聚类，以在ZOTUs的99%同一性下进行额外聚类，生成ZOTUs。ZOTUs基于错误率模型估计推断，并将配对reads合并为一个序列，最小重叠为30个碱基。最后，在其中一个阴性对照中以相对比例 > 0.1%发现的ZOTUs也从所有样品中丢弃。使用USEARCH包中实现的SINTAX算法，使用置信度阈值80%（科级）和70%（属级），以及MIDORI2参考数据库，对ZOTU序列进行 taxonomic 分配。

3.4 统计分析

对于基于底栖大型无脊椎动物样本的大型无脊椎动物指标和基于eDNA分析的ZOTU丰富度，使用单因素方差分析（ANOVA）后的Dunnett多重比较检验检查金属污染地点（A0, A2–4）与参考地点（A1）之间的差异。基于底栖大型无脊椎动物样本的丰富度和丰度指标进行log₁₀转换以符合该分析的假设。

对于底栖样本，基于Bray–Curtis相异性的非度量多维标度（NMDS）用于比较研究地点之间的大型无脊椎动物群落。使用大型无脊椎动物分类单元丰度的平方根转换来计算Bray–Curtis相异性。类似地，对于eDNA，基于使用ZOTUs存在-缺失数据的Jaccard相异性进行NMDS。使用R包“vegan”（v.2.6.4）在R（v.4.3.1）中进行NMDS分析。对于eDNA，进行相似性百分比分析（SIMPER）以识别导致地点之间观察到的分离的ZOTUs。

4 结果与讨论

4.1 水质与大型无脊椎动物

下游金属浓度的增加以及对许多大型无脊椎动物指标的显著影响与Iwasaki et al. (2023)报告的发现一致。虽然参考地点（A1）的金属浓度远低于在水硬度为15 mg CaCO₃/L时的美国EPA水质标准（Cu: 1.8 μg/L; Zn: 24 μg/L; Cd: 0.17 μg/L; Pb: 0.30 μg/L），但金属污染地点（A0, A2–A4）的金属浓度（除Pb外）超过了这些标准。特别值得注意的是Cu标准的超标；A0和A2的浓度分别约为标准值的50倍和16倍。这一结果表明这些污染地点存在显著的生态风险。

总共，我们在所有底栖样本中收集了2814个大型无脊椎动物个体，代表117个分类单元。正如从金属浓度预测的那样，在A0收集的大型无脊椎动物中约90%是摇蚊（双翅目），并且没有收集到蜉蝣。大多数丰度和丰富度指标在下游金属污染地点（A2–A4）显著低于参考地点A1。然而，在有限地点（特别是A3和A4）的一些大型无脊椎动物指标，如baetid蜉蝣（Baetidae）的丰度（通常在严重金属污染的河流中发现），与A1没有显著差异。尽管由于样本量小（每个地点三个重复）导致统计功效有限，但这些结果揭示了A1的大型无脊椎动物群落与其他污染地点（A0, A2–A4）的群落之间存在明显区别。

有趣的是，从A2收集的一个大型无脊椎动物样本的分类单元丰富度与参考地点（A1）相当，并且丰富度和丰度指标的变化在A2比其他地点更大。A2的这些结果可能是由于临时占据了从紧接上游参考区域（包括地点A1）漂流而来的大型无脊椎动物分类单元。先前的研究已经讨论了这种漂流在评估金属污染对大型无脊椎动物影响的重要性。

基于所有研究地点所有大型无脊椎动物样本的Bray–Curtis相异性的NMDS结果也显示， tributary 地点（A0）的群落与参考地点（A1）和污染地点（A3和A4）的群落明显分离，而地点A2的群落绘制在这四个地点之间。应当注意，对于位于较小 tributary 的A0，没有合适的参考地点。由于其栖息地特征可能与干流参考地点（A1）不同，金属污染以外的因素可能导致它们之间观察到的底栖群落差异。然而，考虑到在下游地点（A2–A4）观察到的 substantial 和一致的变化，金属污染很可能是A0观察到的差异的主要驱动因素。

4.2 eDNA分析

从所有样品中总共获得了2,892,569条原始序列 reads，其中2,793,679条通过了序列质量过滤器并用于创建ZOTUs（平均186,245 reads/样品）。总共形成了2215个ZOTUs，其中510个与阈值匹配并被鉴定为昆虫纲。A0的所有六个ZOTU丰富度指标（即总ZOTUs、EPTD、蜉蝣目、襀翅目、毛翅目和双翅目）比参考地点A1低24%–74%。然而，与大型无脊椎动物结果相反，ZOTU丰富度指标在参考地点和下游污染地点相似。事实上，尽管在大型无脊椎动物收集中观察到显著减少，但在A1检测到的Baetidae、Ephemerellidae和Heptageniidae的ZOTUs在大多数情况下也在下游污染地点以相似的 reads 数量检测到。这些结果清楚地表明，使用eDNA的ZOTU丰富度指标未能检测到在下游污染地点（即A2–A4）观察到的大型无脊椎动物的显著减少。

基于eDNA数据的NMDS分析表明，A0与其他地点之间的群落相异性 remarkably 大。虽然这一结果与基于ZOTU丰富度指标的结果一致，但它使得对A1和下游污染地点进行详细比较变得困难。基于主流地点（即除A0外）eDNA数据的NMDS结果视觉上揭示了A1与A2之间以及A3与A4之间的适度分离。然而，即使是A1与A3或A4之间的差异在统计上也不显著，很可能是由于样本量小（n = 3）。

通过SIMPER分析选择对A1与A2以及A3与A4之间分离有显著贡献的ZOTUs，最常导致来自双翅目的ZOTUs（在选定的30个ZOTUs中有13个），其次是来自六个目的1–6个ZOTUs：鞘翅目（6个）、半翅目（4个）、鳞翅目（3个）、襀翅目（3个）、毛翅目（2个）和脉翅目（1个）。没有来自蜉蝣目的ZOTUs被选为“指示”ZOTUs，很可能是因为一致检测到来自Baetidae、Ephemerellidae和Heptageniidae的ZOTUs，而这些在污染地点（A2–A4）的底栖样本中很少收集到。基于eDNA检测的这些结果相当 counterintuitive，因为ephemerellid和heptageniid蜉蝣已被报道是对金属敏感的分类单元。许多选定ZOTUs的出现通常仅在A1和A2或仅在A3和A4。然而，由于缺乏关于eDNA检测到的选定“指示”分类单元的金属耐受性信息，很难说金属污染是否是这些特征性出现的原因。例如，一些摇蚊已被报道对金属敏感，但由于形态学鉴定在物种水平上的挑战，很难对eDNA和底栖收集结果进行 rigorous 比较。

尽管选定的ZOTUs的响应可能是由金属污染以外的因素（例如，自然纵向变化）引起的，但令人鼓舞的是，基于eDNA数据的NMDS分析使得区分参考地点（A1）和污染地点（A3和A4）成为可能，尽管结果在统计上不显著。相比之下，在A2（距A1约150米下游）获得的eDNA结果很可能受到源自参考区域（包括A1）群落eDNA下游漂移的 substantial 影响。这一可能性表明，在如此短的距离内使用eDNA评估大型无脊椎动物群落变化的困难，无论在下游地点观察到的影响有多大。因此，使用大型无脊椎动物eDNA作为传统底栖样本上游-下游比较的替代方法尚不 straightforward。一个有前途的解决方案是使用环境RNA（eRNA），它在野外比DNA降解得更快，因此反映了局部和 immediate 生物信号。

在本研究中，最终用于我们分析的ZOTUs数量在不同分类群中有所不同，并且双翅目分类单元经常被选为指示ZOTUs。具体来说，双翅目中的摇蚊科包含了在总共510个ZOTUs中保留的269个ZOTUs。然而，我们在蜉蝣目中仅保留了26个ZOTUs。造成这种差异的一个可能原因是本研究中使用的COI引物更有效地扩增了双翅目DNA。该引物组具有检测淡水大型无脊椎动物（蜉蝣目、襀翅目、毛翅目和双翅目）的优势，因为它最大限度地减少了非目标DNA（如藻类DNA）的扩增。然而，为了最小化种内扩增偏差，针对系统发育上保守的线粒体16S rRNA区域的引物可能更合适。另一个原因可能是跨物种注册为参考DNA的序列数量差异会影响 taxonomic 鉴定过程。事实上，数据库中注册的双翅目序列数量（1,244,578） substantially 大于蜉蝣目（23,945）。特别是，日本摇蚊科（双翅目中的一个科）的数据库建立良好，并包含大量注册序列。考虑到昆虫的高遗传多样性以及对现有DNA参考数据库准确性的固有担忧，扩展可靠的本地DNA条形码信息至关重要。这样的发展有助于克服与相对较小空间尺度评估相关的局限性，例如本研究中进行的上游-下游比较，并最终有助于 informed 考虑大型无脊椎动物eDNA方法的最佳用途。