应用环境DNA（eDNA）技术监测濒危布罗隆蛙（Litoria booroolongensis）残存与迁地种群的分布动态及其保护意义

本文开发并验证了一种针对濒危物种布罗隆蛙（Litoria booroolongensis）的环境DNA（eDNA）特异性检测方法（qPCR），成功在实验室（ex situ）和野外河流（in situ）水体样本中实现高灵敏度、物种特异性的检测。该研究为濒危两栖动物的分布监测、种群评估及保护管理提供了高效可靠的技术工具，凸显eDNA在生物多样性保护和物种恢复中的应用潜力。

　　

摘要

本研究旨在开发并验证一种针对濒危布罗隆蛙（Litoria booroolongensis）的环境DNA（eDNA）检测方法，以支持其种群分布监测与保护管理。通过物种特异性引物和探针设计、实验室灵敏度验证、ex situ（动物园饲养环境）与in situ（自然河流）水体采样与qPCR检测，系统评估了该方法的可靠性与适用性。

1 引言

全球两栖动物种群正经历急剧衰退，布罗隆蛙作为澳大利亚东部山地溪流特有的濒危物种，其分布范围自1980年代以来已缩减超过一半。传统监测方法如夜间视觉调查和鸣声识别，存在劳动强度大、覆盖范围有限、对专业人员依赖性强等局限。环境DNA（eDNA）技术通过检测水体中的物种DNA痕迹，为物种分布监测提供了高灵敏度、非侵入性的新途径，尤其适用于稀有、隐存或濒危物种。

2 方法

2.1 eDNA检测方法开发

从GenBank及博物馆标本中获取布罗隆蛙及其同域近缘物种（如L. wilcoxii、L. lesueuri等）的线粒体16S基因序列，通过比对分析设计出针对布罗隆蛙155 bp片段的高度特异性引物与TaqMan探针（表1）。所有引物探针均通过in silico特异性验证（Primer-BLAST），确保无跨物种扩增。

2.2 eDNA检测灵敏度与特异性

使用合成gBlock片段进行梯度稀释（10–10⁷ copies/μL），以12次重复PCR确定检测限为36 copies/反应。特异性测试表明，该 assay 可准确扩增所有布罗隆蛙样本（包括东西部种群），且不与近缘物种交叉反应。

2.3 Ex situ eDNA验证

在Taronga动物园的布罗隆蛙饲养设施中，采集四种处理水样：西部种群饲养缸水、东部种群饲养缸水、成体蛙短暂浸泡水（15分钟）及卵块浸泡水（30分钟）。所有水样均通过Smith-Root eDNA采样器过滤（5 μm自保存滤膜），每处理3次重复。qPCR检测设置阈值Cq≤34.3（以设备对照Cq=37.6为背景污染基准）。结果显示，成体蛙与卵块处理水样均呈强阳性（Cq 20.0–31.3），而饲养缸水样因UV过滤处理可能导致DNA降解，检测信号较弱。

2.4 In situ 分布研究

于2023年12月（繁殖季高峰）在Murray-Darling盆地15个站点进行eDNA采样。每个站点采集3个重复滤膜样本，采样顺序自下游至上游以避免交叉污染。所有站点均记录水质参数（pH、水温、浊度等）。qPCR检测结果显示，eDNA阳性站点（4/15）与先前夜间调查的“已知存在”或“推测存在”状态高度一致，而未检测到信号的站点均属“推测缺失”区域。值得注意的是，在人工 reintroduction 站点（9个月前释放638只蛙）仅1个重复样本呈阳性，下游5 km处即无检测，可能与种群规模、冬季死亡率及低水流条件有关。

3 结果

3.1–3.4

所开发的 assay 在特异性、灵敏度（检测限36 copies/反应）、ex situ 与 in situ 验证中均表现良好。在野外调查中，eDNA检测结果与传统调查高度一致，且成功拓展至未调查站点。卵块与成体蛙的短时暴露实验证实eDNA释放迅速，且首次证明未受精卵块亦可作为eDNA来源。

4 讨论

4.1 eDNA与传统调查的一致性

本研究中eDNA检测结果与11个月前的夜间调查高度吻合，证明eDNA可作为布罗隆蛙分布监测的有效工具，且具备覆盖范围广、劳动强度低、对物种无干扰等优势。

4.2 不同生活史阶段的eDNA释放

成体蛙仅15分钟水暴露即可产生可检测eDNA；卵块（包括胶质层）在30分钟内释放DNA，此为首次在蛙类中证实未受精卵的eDNA可检测性，提示繁殖季监测可进一步提高检出率。

4.3 检测灵敏度与污染控制

尽管设备对照中检测到背景DNA（可能源于饲养设施用水），但通过阈值设定（Cq≤34.3）有效区分真实信号。东部种群饲养缸水样信号弱，可能与封闭循环系统中的UV处理导致DNA降解有关。

4.4 下游传播限制

与其他研究相比，本研究中eDNA下游传播距离有限（<5 km），可能与低种群密度、冬季死亡率、极低水流条件（<0.01 m³/s）有关，提示水文条件与种群规模是影响eDNA检测范围的关键因素。

4.5 其他影响因素

eDNA持久性（约1个月）、底泥DNA残留、PCR抑制（虽稀释测试未发现）及潜在杂交风险（与L. wilcoxii）可能影响检测结果解读，建议未来研究关注底泥-水界面DNA动态及持久性实验。

4.6 eDNA技术在保护中的应用

本研究开发的 assay 可直接用于布罗隆蛙的分布筛查、复育站点优先选择及灭绝确认。eDNA技术使得大范围、低频次监测成为可能，符合稀有物种监测的优化策略（以站点数量换强度），有助于长期跟踪种群动态及气候变化响应。

作者贡献、致谢与伦理声明

研究由R.W., D.C., M.M. 等多位作者共同设计并执行；标本由多家博物馆提供；工作获原住民土地传统所有者认可；所有操作均符合动物伦理许可（221011-02）；作者声明无利益冲突。