利用环境DNA(eDNA)宏条形码技术解析番木瓜与菠萝的食果动物互作网络：农业生态监测的新视角

本综述创新性地将环境DNA(eDNA)宏条形码技术应用于水果表面生物残留检测，成功解析了番木瓜(Carica papaya)与菠萝(Ananas comosus)的食果动物群落结构。研究通过COI基因片段测序获得796,234条读长，鉴定出117个ASV，揭示了节肢动物(97.61%)为主导的互作网络，包括果蝇属(Drosophila)、锯蝇属(Zaprionus)和脊椎动物等关键物种。该方法为农业害虫监测和生物互作研究提供了非破坏性、高通量的技术解决方案。

　　

1 引言

植物-动物互作(PAI)在自然和农业生态系统的能量流动中起着核心作用，涵盖捕食、食果、草食、寄生和互利共生等多种形式。传统监测方法如形态学识别和相机陷阱在速度和可扩展性方面存在局限，难以满足大规模生物多样性监测的需求。近年来，环境DNA(eDNA)宏条形码技术作为一种非破坏性物种互作检测手段展现出巨大潜力。

环境DNA生物监测因其非破坏性、高精度和成本效益而备受关注，已成功应用于物种存在/缺失、相对丰度、栖息地偏好、种群遗传学和物种互作等研究。尽管eDNA在花朵、叶片、树皮甚至茶叶等基质上的应用已有报道，但水果作为互作研究载体仍未被充分探索。水果被食果动物直接啃咬、咀嚼或舔舐时，其表面可能沉积唾液、皮肤细胞等生物材料，且易于采集和自然积累互作信号，使其成为eDNA研究的理想基质。

2 材料与方法

2.1 研究区域与采样

研究在台湾嘉义县民雄乡国立中正大学(北纬23.558754°，东经120.472276°)5公里半径范围内的农业农场进行。样品分为两类：部分取食/受损果实和完整果实(对照)。2022年3月至5月期间共采集36个部分取食果实和6个完整果实。采样期间平均气温16-28°C，月降雨量100-167毫米，恰逢梅雨季节初期。

2.2 水果表面eDNA采集

使用塑料喷雾瓶向水果表面喷洒双蒸水，收集300毫升径流液并通过0.45μm混合纤维素酯滤膜过滤。滤膜分成两半，分别保存于Longmire缓冲液(长期存档)和ATL缓冲液(DNA提取)。同时设置田间、积累和过滤空白对照。

2.3 DNA提取与PCR扩增

使用DNeasy Blood & Tissue Kit进行DNA提取，并进行以下优化：滤膜切碎、60°C过夜裂解、AE缓冲液37°C双重孵育。采用针对后生动物的通用引物mICOIintF和jgHCO2198扩增约313bp的线粒体COI基因片段。每个样品进行三次PCR重复，空白样品无可见扩增。

2.4 文库构建与测序

使用TruSeq Nano DNA Library Prep Kit制备文库，在Illumina MiSeq平台上进行300bp双端测序，预期测序深度为每个复合样品约240,000条读长。

2.5 数据处理

使用Trimmomatic去除适配器和低质量碱基，Cutadapt修剪引物序列。通过DADA2进行去噪、嵌合体去除和ASV分配。使用BLASTN比对GenBank数据库，采用最低共同祖先(LCA)方法进行物种分类。

2.6 统计分析

使用R语言进行统计分析，包括稀有曲线分析、基于Jaccard相似性矩阵的非度量多维尺度分析(NMDS)、基于Bray-Curtis相异性的PERMANOVA检验，以及DESeq2差异丰度分析。

3 结果

3.1 分类组成

经过滤和去噪后，从42个水果样品中获得1,692,642条单端读长(对应796,234条双端读长)。平均每个水果产生56,873±15,733条读长。最终保留196,869条读长和41个ASV，全部为动物类群。

节肢动物门占主导地位(97.61%)，其次是轮虫动物门(1.52%)、脊索动物门(0.79%)和线虫动物门(0.06%)。脊索动物门的三个ASV分别对应爪哇八哥(Acridotheres javanicus)、赤腹松鼠(Callosciurus erythraeus)和板齿鼠(Bandicota indica)。

昆虫纲占节肢动物读长的53.79%，其中双翅目占97.01%，鞘翅目占2.31%，膜翅目占0.13%。检测到的主要果蝇种类包括 Drosophila takahashii、D. bipectinata、D. malerkotliana、D. ananassae、D. immigrans 和 D. eugracilis，以及桔小实蝇(Bactrocera dorsalis)和锯蝇属(Zaprionus sp.)。

3.2 取食与完整果实的比较

取食果实样品以昆虫(90%-95%)和哺乳动物(4%-5%)DNA为主导，而完整果实以轮虫(75%-80%)和昆虫(20%-25%)为主。主要食果动物类群为果蝇属(Drosophila)、锯蝇属(Zaprionus)和松鼠属(Callosciurus)，其中果蝇属在所有样品中丰度最高。

菠萝样品包含15个独特ASV，番木瓜样品有11个独特ASV，两者共享15个ASV。菠萝特异性类群包括 D. ananassae、D. bipectinata 和 D. malerkotliana，而番木瓜特异性类群包括 Tapinoma sp.、A. javanicus、A. fasciculatus 和 Burmoniscus sp.。

取食与完整样品的分类组成也存在差异。取食菠萝和番木瓜样品分别检测到15和11个独特ASV，另有4个ASV为两种取食果实独有。完整样品仅检测到1个独特ASV。

4 讨论

4.1 分类组成与昆虫群落结构

节肢动物门特别是昆虫纲在检测到的ASV中占主导地位，主要为水果相关物种。约33.32%的读长来自非目标类群(真菌33.14%，植物0.17%，细菌0.01%)，表明未来研究可能需要更多类群特异性引物。大量ASV无法分类，可能由于当前参考DNA数据库的局限性。

高比例的果蝇( Drosophila spp. 和 Bactrocera dorsalis)和甲虫( Araecerus fasciculatus 和 Carpophilus marginellus)表明这些类群是丰富的食果动物和分解者。脊椎动物食果动物如爪哇八哥、赤腹松鼠和板齿鼠的检测结果与田间观察和农民报告一致。

4.2 菠萝与番木瓜群落的比较分析

取食果实比完整果实显示出更强的eDNA信号，支持部分取食果实包含更强互作特征的假设。α和β多样性分析揭示了菠萝和番木瓜样品在分类组成上的明显差异。与每种水果类型相关的独特ASV表明某些类群可能基于糖含量、质地或化学/气味特征等水果特性表现出特化或偏好。

4.3 取食与完整果实的差异

取食与完整果实之间观察到显著的分类组成差异，取食果实表现出更高的ASV丰富度和更多样化的节肢动物组合。这种模式可能反映了由于开放果皮和成熟状态而增加的可接近性和营养可用性，吸引了更多分解者、食果动物和机会性物种。

4.4 农业害虫识别与入侵生态学意义

检测到的多样物种包括食果性、吸汁性和杂食性类群，突出了水果作为关键互作位点的作用。害虫物种如吸汁甲虫 Carpophilus marginellus 和仓储产品害虫 Araecerus fasciculatus 的存在表明它们与水果的互作。其他农业害虫如爪哇八哥、板齿鼠和桔小实蝇也在水果样品中被识别。

4.5 局限性与未来展望

本研究存在一些需要进一步评估的局限性。作为试点研究，有限的样本量限制了我们得出更广泛结论的能力。扩大水果样品的数量和多样性，以及更广泛的采样地点，将增强研究结果的稳健性。

使用更特异性引物靶向不同分类群，如针对鸟类(MiBird)、哺乳动物(Mimammals)和脊椎动物(Mod_RepCOI_F/VertCOI_7216_R; VertU)的引物，可以增强分类分辨率。将eDNA与传统调查技术相结合并开发全面的参考数据库，对于其在生态管理中的有效应用至关重要。

5 结论

本研究强调了基于eDNA的方法能够通过解析分类组成来检测水果上的PAI。通过eDNA宏条形码从取食果实中检测到的各种生物信号使我们能够捕获广泛的分类群，揭示物种互作和生态关系的见解。与每种水果类型相关的独特ASV表明某些类群可能基于水果特性如糖含量、质地或化学/气味特征表现出偏好。

eDNA方法需要有限的分类学专业知识，较少劳动力，且快速有效的监测，可用于监测生态和经济重要的物种互作。这种生物监测方法可用于野生动物和农业领域的常规监测评估，以支持适当的管理决策。未来的工作应旨在通过控制实验、时间序列采样以及与视觉或相机观察的整合来验证这些发现。