整合环境DNA与视觉调查及海洋漂移模型以监测热带水域海洋哺乳动物

本文综述了在热带水域（以留尼汪岛为例）整合环境DNA（eDNA）宏条形码技术与传统视觉调查及海洋粒子漂移模型（如ICHTHYOP），用于监测海洋哺乳动物多样性的创新方法。研究通过优化无冷链存储的eDNA采样流程，成功检测到多个鲸豚物种（如Delphinidae、Balaenopteridae），并与长期视觉监测数据对比，验证了eDNA在物种检测中的高灵敏度与互补性。同时，利用Lagrangian模型模拟eDNA扩散轨迹，揭示了其空间来源与持久性（仅数小时至2天），为热带海洋生物多样性评估与保护提供了高效、低成本的工具（eDNA metabarcoding）。

　　

1 引言

留尼汪岛作为西南印度洋的法属海外领土，近年来人类活动加剧对沿海海洋栖息地造成显著威胁，包括化学污染物（如Dirtu et al. 2016）、不可降解碎片（Simmonds 2012）及声学污染（Borggaard et al. 1999）等。鲸豚类动物面临船只交通、观鲸活动等行为干扰（Barra et al. 2020），气候变化进一步影响其分布（Albouy et al. 2020）。自2004年起，该地区通过视觉和声学调查对海洋哺乳动物进行持续监测，已记录25种鲸豚类物种（Dulau-Drouot et al. 2008），包括常年栖息沿岸的印太瓶鼻海豚（Tursiops aduncus）、普通瓶鼻海豚（Tursiops truncatus）及长吻飞旋海豚（Stenella longirostris longirostris），以及冬季繁殖的座头鲸（Megaptera novaeangliae）。

环境DNA（eDNA）技术作为一种非破坏性、高效的工具（Bohmann et al. 2014），在海洋生物多样性监测中展现出潜力，可用于鱼类（Thomsen et al. 2012）、脊椎动物（Closek et al. 2019）及入侵物种检测（Rishan et al. 2023）。然而，在资源有限的热带地区（如留尼汪岛），eDNA应用于鲸豚类监测仍处于探索阶段。本研究旨在评估eDNA宏条形码在热带水域鲸豚物种检测中的有效性，优化现场采样协议，比较eDNA与视觉调查结果，并利用海洋漂移模型分析eDNA信号的空间动态。

2 材料与方法

2.1 样品采集

2018年5月至2019年6月期间，从留尼汪岛周边海域的小型船只上采集表层海水样品，覆盖鲸类迁徙期与非迁徙期。采样在无冷链存储条件下进行，使用无菌5升瓶收集海水，每样品过滤10升（2×5升）。采样时人员穿着防护服与丁腈手套，避免交叉污染。水样通过蠕动泵连接Sterlitech滤芯（0.45 μm）过滤，滤膜保存于RNAlater溶液或Longmire缓冲液，运输中冷藏并于当日冷冻（-20°C）。现场空白样通过Nanodrop和Qubit检测确认无DNA污染。

2.2 eDNA遗传处理

2.2.1 引物选择

经测试多种引物后，选择MiMammal引物（Ushio et al. 2017）靶向线粒体12S rRNA基因的高变区，以扩增脊椎动物及哺乳类DNA。

2.2.2 DNA提取与扩增

滤膜经ATL缓冲液和蛋白酶K裂解后，使用DNeasy Blood & Tissue Kit（Qiagen）提取DNA。为增加产量，对Merck滤膜处理15 mL裂解液。PCR扩增采用12次重复，反应体系包含Phusion Green Hot Start II Master Mix、尾端引物、人源阻断引物（5′-TAA GCT ATA CTA ACC CCA GGG TTG GTC AAT T-3′）、BSA及DMSO。扩增条件为98°C 3分钟，45循环（98°C 20秒、69°C 15秒、72°C 15秒），最终72°C延伸5分钟。阴性对照与阳性对照（模拟群落）同步处理。

2.2.3 测序与数据处理

使用Illumina MiSeq V2试剂盒进行测序，数据通过NatureMetrics定制流程处理：USEARCH合并双端读段，CUTADAPT修剪引物，质量过滤（错误率≤0.05），UNOISE去噪（最小丰度8）。序列与NCBI GenBank数据库比对，物种鉴定基于≥99%相似度（e值1e-20，覆盖度80%）。仅保留种或属水平鉴定结果。

2.3 组织样本遗传分析

对两种本地物种（Tursiops aduncus和Stenella longirostris longirostris）的皮肤活检样本进行线粒体12S测序，设计三对引物（12S_F1/R1、12S_F2/R2、12S_F3/R3）以补充参考数据库。测序结果与NCBI现有序列100%一致。

2.4 物种特异性qPCR引物设计

针对Tursiops aduncus和Stenella longirostris设计qPCR引物，但测试显示与eDNA宏条形码结果一致性有限，仅1个样本（Area 2）三种方法均检测到S. longirostris。因灵敏度不足，未进一步采用靶向方法。

2.5 空间分析与粒子漂移模型

视觉调查记录物种、GPS位置及个体数，与eDNA检测结果对比。使用QGIS绘制分布图，并结合2008-2019年历史观测数据计算目击率。利用ICHTHYOP Lagrangian模型模拟反向粒子漂移（1-7天），以评估eDNA空间来源。模型基于GLORYS12V1海洋再分析数据（分辨率1/12°），释放10,000个粒子/站点，仅考虑平流效应。

3 结果

3.1 滤膜性能

Sterlitech滤膜在体积、成本与污染风险间取得最佳平衡。

3.2 引物测试

MiMammal引物产生较高DNA产量与分类分辨率。尽管加入人源阻断引物，测序读段中仍以人类DNA为主（81.7%），其他污染源（牛、猪、狗等）占8.5%，鲸豚类读段仅占9.8%。

3.3 环境参数

海表温度（SST）介于25.3-29°C（均值27.5°C），pH为8.2。风速与SST未显示与eDNA检测量显著相关，但高风速（>5节）下序列数较多。

3.4 海洋哺乳动物eDNA检测

20个站点中，eDNA检测到6物种：座头鲸（Megaptera novaeangliae）、Pantropical斑点海豚（Stenella attenuata）、飞旋海豚（Stenella (longirostris)）、印太瓶鼻海豚（Tursiops aduncus）、普通瓶鼻海豚（Tursiops truncatus）及小抹香鲸（Kogia breviceps）。除S. longirostris相似度为97.08%（因4个核苷酸差异），其余物种均100%匹配NCBI。eDNA在14次视觉目击附近检测到9次（64.3%重合），另在11个无目击站点检测到物种，显示其更高灵敏度。

3.5 eDNA与视觉调查对比

视觉记录5物种14次目击，eDNA检测到30次遗传信号。26%检测重合，60%为eDNA独有，14%为视觉独有。eDNA分布与历史物种范围一致，如S. longirostris读段集中分布于其高目击率区域。

3.6 粒子漂移模拟

反向漂移显示多数eDNA源于采样点附近，仅6个站点粒子可能源自远岸（>100 km）。结合eDNA在高温下持久性短（27.5°C时仅数小时至2天），表明检测信号反映本地近期存在。

4 讨论

4.1 eDNA遗传检测

本研究证实eDNA宏条形码在热带水域鲸豚监测中的有效性，检测物种数超过视觉调查，尤其揭示罕见物种（如Kogia breviceps）。采样协议优化（过滤时间15-20分钟）适合资源有限场景。PCR重复（12次）降低假阳性风险。但人源DNA污染突出，需进一步优化阻断策略或采用CRISPR-Cas富集技术（Kardailsky et al. 2024）。S. longirostris的低匹配度可能源于数据库不足或亚种变异，凸显本地参考序列的重要性。

4.2 eDNA与扩散漂移

漂移模型与eDNA持久性数据（高温下降解快）表明检测信号主要反映本地来源，支持eDNA用于分布评估。然而，海洋环境中的eDNA状态（自由vs.囊封）与降解因素（酶、UV、温度、pH）复杂，需结合环境参数解读。eRNA或为更实时指标（Qian et al. 2022）。

4.3 eDNA检测局限

物种体型、行为、密度及采样方法影响eDNA产量。 mysticetes（如座头鲸）检测率低，可能因eDNA释放量少。未来需开发物种特异性qPCR与高分辨率熔解曲线（HRM） assay（如Robinson et al. 2024），但组织样本获取困难。数据库覆盖度不足与引物特异性限制鉴定准确性，需多方法互补（视觉、声学、eDNA）。

总之，eDNA宏条形码为热带海洋哺乳动物监测提供高效工具，但需结合漂移模型、环境参数与多技术验证，以提升数据可靠性与保护应用。