极端环境中历史土地利用驱动现代微生物群落构建的系统发育研究

本研究通过系统发育多样性分区框架，揭示了干旱区历史农业活动（如海枣种植的洪水灌溉）和自然干湿循环如何通过谱系周转（phylogenetic turnover）和生态位宽度变化塑造现代微生物群落。研究发现短期干扰促进细菌系统发育聚类和多样性，而长期扰动强化选择过程；稀有类群对土地利用更敏感，优势类群则表现出更广泛的生态位适应性。该研究为退化旱区生态系统恢复提供了以硅（Si）含量为关键调控靶点的科学依据。

　　

摘要

本研究通过系统发育多样性分区框架，结合土壤成分分析，旨在揭示历史干扰对极端环境（如沙漠）中现代细菌和真菌群落的影响，并区分丰富和稀有类群。研究结果表明，历史上的农业活动促进了强烈的系统发育聚类和谱系周转，同时增加了系统发育多样性和生态位宽度，反映了短暂资源可用性和生态位多样化的影响。相反，长期干扰减少了系统发育多样性和生态位宽度，同时放大了选择过程和谱系周转。这些模式表明该系统中非生物约束加剧，历史偶然性——以持久的干湿循环为特征——差异性地塑造了细菌和真菌群落。稀有类群对土地利用更敏感且更受确定性过程影响，而丰富类群表现出更广泛的生态位适应性和随机影响，凸显了需要有针对性的保护策略。

1 引言

沙漠生态系统承受着极端的非生物胁迫，包括高温、有限的水资源以及贫瘠的土壤养分和有机质含量。这些限制将农业活动限制在适应干旱气候的特定作物上，其中海枣是中东地区广泛种植的标志性作物。然而，其种植需要大量的水输入，传统上通过洪水灌溉提供，这通常导致土壤盐渍化和硬化。这些过程会降解土壤理化性质，改变微生物组功能，并削弱基本的生态系统服务。尽管海枣被广泛种植，但其对微生物群落组成——特别是其构建——的长期影响仍然知之甚少，这阻碍了沙漠生态系统中可持续农业和恢复策略的发展。

在沙漠中，低水可用性和长期干旱是土壤微生物群的主要关键胁迫因子。微生物发展出适应性策略，如进入休眠状态以抵御如此严酷的非生物条件。例如，芽孢杆菌门（Bacillota，原厚壁菌门Firmicutes）细菌能够形成内生孢子，使它们能够耐受干燥和其他极端胁迫。休眠是旱地微生物中普遍存在的现象，有助于保存土壤中重要的遗传库，从而维持高水平的微生物多样性。沙漠微生物也对偶发性降雨做出快速反应，在短暂的湿润期激活代谢和生长。在这些高度受限的生态系统中，耐旱性成为驱动微生物群落组成和构建的功能性状。因此，超干旱沙漠中干湿循环的中断预计会深刻影响土壤微生物组，但这方面的记录仍然不足。

土壤微生物组对植物营养和胁迫耐受性至关重要，提供诸如养分循环等关键生态系统功能。理解微生物群落如何在土壤中构建，并量化响应干扰塑造它们的基本过程，是微生物生态学中一个具有挑战性的课题。一个基于生态位和中性理论的概念框架将微生物群落构建机制分为四个一般过程，包括选择（确定性过程），以及漂变、扩散和多样化（主要为中性或随机过程）。土壤微生物组中的选择受非生物因素（如气候、温度、降雨和土壤组成）以及生物因素（如物种相互作用和胁迫耐受机制）的影响。另一方面，随机过程涉及随机事件，如出生、死亡和扩散。确定性和随机过程都有助于微生物构建，它们的相对重要性根据生态系统特性和特定干扰而变化。

例如，选择已被确定为森林林分和可耕地中细菌构建的关键驱动因素，其中细菌群落的系统发育距离与土壤特性和土壤风化指数相关。类似地，随机过程在塑造细菌、真菌和原生生物群落中至关重要，这些群落在不同类型的生态系统（如洪泛区或农田）中有所不同。因此，确定性和随机过程在影响微生物群落组成方面是互补的。确定性和随机过程之间的差异通常可归因于环境特性和土地利用模式的不同。例如，与森林相比，草原表现出较低的β多样性，可能是由于中性过程占主导地位，导致物种周转减少；相反，确定性因素增加了森林和免耕农业系统中的β多样性。施肥实践进一步说明了这些动态，因为化学施肥强烈选择某些细菌群落，而有机质改良促进随机过程。此外，长期施肥已被证明可以减少土壤中参与碳和氮固定的微生物群系中的随机性，这些土壤来自自1870年以来存档的长期草地实验。这些发现强调了时间动态的重要性，因为过去的事件可能对微生物构建产生遗留效应。

在微生物生态学中，历史偶然性——定义为历史事件对群落组成的长期影响——在塑造群落方面起着基础性作用。这些包括诸如优先效应等机制，其中生态位抢占或修改基于竞争排斥和限制相似性原理影响定殖和持久性。例如，物种扩散的时间可以作为影响群落结构的确定性因素。数学模型进一步证明，历史偶然性可以影响微生物对干扰（如水文变化）的恢复力。在模拟环境中，历史偶然性，包括滞后效应，影响了竞争相同资源的微生物群落，导致不同的轨迹。虽然历史偶然性和干扰的影响已在受控环境或温带系统中进行了探索，但对其在塑造沙漠生态系统土壤微生物群落中的作用了解相对较少。关于历史偶然性对面临干扰的沙漠环境中土壤微生物群落构建过程的影响，这一主题在自然环境中仍然具有挑战性。

弥合这一知识差距对于评估过去的农业活动如何改变了沙漠生态系统以及为可持续农业和恢复实践提供信息至关重要。在之前的一项研究中，我们证明了农业活动如何与自然干扰和未受干扰地点相比，破坏了微生物网络的稳定性。然而，我们仍然缺乏关于受干扰差异影响的分类群，以及土壤特性与微生物群落周转之间联系的见解，这些见解可能有助于这些生态系统的恢复和保护。在本研究中，我们调查了过去的洪水——包括自然的（例如，蒸发盆地的年度洪水）和人为的（例如，海枣种植期间的每日洪水灌溉）——对关键沙漠植物物种^{Haloxylon salicornicum}根际微生物组成、多样性和构建的影响。我们试图通过系统发育结构变化来量化和表征过去洪水事件和强度对当前微生物群落构建的影响，以及土壤参数对其周转和嵌套性的影响。此外，我们区分了稀有和丰富类群，已知它们表现出不同的扩散能力和资源偏好。稀有类群通常更受扩散限制，而丰富类群表现出更大的底物普遍性。因此，干扰可能基于微生物类群丰度产生对比效应。我们假设：（i）历史偶然性将主要驱动群落构建，与自然生态系统相比，确定性/生态位过程的比例更大。（ii）丰度水平（稀有与丰富类群）将影响微生物系统发育结构和构建过程。（iii）严酷的沙漠环境条件将促进强烈的系统发育聚类，反映微生物群落中的生态位保守性。

我们的研究结果旨在阐明历史偶然性、干湿动态及其产生的土壤干扰在塑造微生物群落方面的相互作用。通过增进我们对极端环境条件下微生物生态学和构建的理解，本研究为沙漠生态系统的可持续管理提供了见解。

2 方法

2.1 数据来源与处理

我们汇编了先前研究中使用的扩增子测序数据，该数据可在NCBI数据库（Bio-project PRJNA1028866, Biosamples SAMN37854590 to SAMN37854744）中获取。该数据集对应于来自五个地点的土壤和根系采样数据，涵盖了具有两个过去干扰水平的自然和受干扰的沙漠环境。将位于悬崖底部区域（Nat 1）和沙丘顶部（水可用性较低，Nat 2）的两个自然环境与两个遗留有海枣种植历史的受干扰地点（OF和LR）以及一个承受强烈非生物胁迫的额外自然地点（蒸发盆地，EB）进行比较。受干扰地点（OF、LR和EB）在干湿循环相关的历史偶然性方面有所不同。农业区在研究前10年被废弃之前经历了短时间尺度上的每日干湿循环（OF, LR），而蒸发盆地（EB）经历了长时间尺度（数十年）上的年度干湿循环。这非常适合研究历史偶然性，因为该超干旱沙漠的主要干扰与干湿循环有关。

在五个地点中的每一个，对^{Haloxylon salicornicum}的土壤、根际和根进行了采样。为了评估细菌和真菌多样性，我们扩增了16S rRNA和ITS2基因，并使用Illumina MiSeq技术对所得扩增子进行了测序。在本研究中，我们特别关注真菌和细菌根际群落，因为与根相关的内生和附生群落构建受不同过程（例如，植物世代间的垂直传播）影响，使其超出我们的研究范围。

2.2 土壤分析

我们测量了已知与土壤微生物组组成相关并被认为在沙漠生态系统中重要的土壤理化参数。使用Knick 766 pH计测量每个土壤样品的pH值（水:土 = 1:5，体积比）。使用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）分析每个地点五个根际样品的子集，以确定过去的农业实践是否对土壤养分含量和组成产生了与自然地点相比的长期影响。作为这些分析的一部分，我们测量了土壤中的有机质含量、氨、石灰岩、阳离子交换容量、氧化钙、Olsen有效磷、交换性氧化钾、硫和凯氏氮。这些结果与先前进行的X射线荧光光谱法（XRF）的数据相结合，XRF量化了镁、铝、硅、磷、钾、钙、锰和铁的丰度。

2.3 稀有和丰富类群过滤

为了评估过去土地利用对丰富和稀有细菌及真菌群落的不同影响，根据类群丰度对数据进行了分类。对于细菌，相对丰度 > 1% 且在所有样品中普遍性阈值达到20%的扩增子序列变体（ASVs）被归类为丰富类群，而相对丰度 < 1% 的ASVs被归类为稀有类群。对于真菌，相对丰度 > 2% 且在所有样品中普遍性阈值达到20%的操作分类单元（OTUs）被视为丰富类群。相对丰度 < 1% 的OTUs被归类为稀有类群。数据集的详细信息，包括样品数量、ASVs和OTUs的数量，以及它们代表的总序列数和平均序列数，在图S1中提供。使用气泡图可视化各地点细菌（门水平）和真菌（属水平）的相对丰度。丰富和稀有数据集的详细结果在图S2和S3中提供。

2.4 系统发育树构建与测序覆盖度

为了研究干扰对不同微生物界系统发育多样性的影响，我们构建了细菌和真菌的系统发育树。使用MAFFT对细菌ASV序列进行比对，并使用IQ-TREE构建系统发育树。鉴于ITS区域是非编码序列，因此是真菌系统发育的不良标记，我们将真菌数据集限制在子囊菌门（Ascomycota，占总序列读长的86%）。然后，我们使用基于树的比对选择器（T-BAS）工具包将我们的序列嫁接至参考系统发育树上，这使得OTU之间的距离具有系统发育意义。这种方法旨在减少真菌系统发育构建中的偏差，并确保OTU之间具有系统发育意义的距离。为了评估测序深度是否足以充分捕获每个样品中的细菌和真菌多样性，我们计算了三个多样性阶数（^q = 0, 1, 2）的覆盖度。

2.5 系统发育多样性量化

我们通过计算不同多样性阶数的系统发育希尔数来量化各地点系统发育多样性的变化。为了检查稀有物种对系统发育多样性的影响，我们通过计算从0到5的多样性阶数的系统发育希尔数，量化了随着更多权重赋予丰富物种时有效谱系数量的变化程度。使用ANOVA检验每个希尔数（^q = 0, 1, 2）在各地点系统发育多样性的差异，然后进行Tukey HSD事后检验。

2.6 环境关系

使用广义加性模型（GAMs）评估每个环境变量对希尔系统发育多样性的影响，每个变量平滑曲线的最大基函数数设置为4（^k = 4），并使用薄板样条。

为了可视化环境变量对微生物群落组成的影响和贡献，进行了冗余分析（RDA）。在分析之前，对微生物丰度进行Hellinger转换，对环境变量进行中心对数比（CLR）转换。这种排序方法突出了微生物类群与环境变量之间的关系，并根据这些相互作用将地点定位在多元空间中。

2.7 识别广布种和特化种

为了评估土壤干扰是否选择了广布种或特化种，我们使用莱文生态位宽度指数计算了每个类群的生态位宽度。高BN值表示宽生态位（广布种），而低值表示窄生态位（特化种）。使用Anova分析各地点以及每个细菌门和真菌纲的BN变化，然后进行Tukey HSD事后检验。

2.8 Beta多样性分区

为了分析与过去土地利用相关的微生物群落构建的Beta多样性组成部分，计算了Baselga指数。对于每个丰度数据集，计算基于Bray-Curtis相异性的总Beta多样性，并将其划分为两个组成部分：丰度的平衡变化（物种替代）和丰度梯度（物种损失）。

此外，进行了系统发育Beta多样性分区，以提供地点之间Beta多样性差异的非中性度量。使用Faith系统发育多样性计算总相异性，并应用S?rensen相异性指数将系统发育多样性划分为周转（物种替代）和嵌套性（物种损失或子集）。所有生成的矩阵在补充图S4中提供，包括作为NMDS图的可视化，以及相关的PERMANOVA R2和显著性在图S5中显示。

为了识别地点之间Beta多样性的显著差异，进行了成对PERMANOVA检验。将得到的显著R2值可视化为网络图，其中连接的强度和颜色表示地点之间差异的大小。

最后，为了评估环境变量与Beta多样性组成部分之间的关系，将广义加性模型（GAMs）应用于每个样品的平均Beta多样性。环境预测因子包括缩放后的pH值和以下土壤元素（闭合至100%并进行clr转换）：铝、硅、磷、钾、锰、镁、钙和铁。基于标记（ITS和16S）、丰度类型（整个群落、丰富类群、稀有类群）和矩阵类型（Bray-Curtis相异性、丰度平衡变化、丰度梯度、S?rensen相异性、系统发育周转、嵌套性）生成了总共36个模型。这些分析捕捉了环境条件和群落组成对各地点微生物群落Beta多样性的影响。

2.9 系统发育结构：NRI和NTI

为了推断和量化地点内的微生物群落构建过程，应用了基于系统发育结构和组成周转的零模型框架。首先，计算净亲缘关系指数（NRI）和最近分类单元指数（NTI）以量化微生物群落的系统发育结构。NRI量化群落内所有类群之间的成对系统发育距离（MPD）。NTI评估每个类群与其最近亲属的平均成对系统发育距离（MNTD）。使用picante包中的^taxa.label函数构建零模型。

2.10 系统发育Beta多样性：βMNTD和βNTI

然后使用丰度加权的β-平均最近分类单元距离（βMNTD）来量化构建过程。为了评估选择在群落构建中的作用，在零假设下生成了预期的βMNTD值（999次随机排列）。然后计算β-最近分类单元指数（βNTI）作为观察到的和零模型的βMNTD分布之间的差异。βNTI值解释如下：|βNTI| > 2 用于推断确定性过程的比例，特别是βNTI > 2 表示可变选择（群落间发散选择），βNTI < -2 表示同质选择（群落间收敛选择）。由此产生的 |βNTI| < 2 值表示影响群落构建的随机过程。我们通过根据Bray-Curtis相异性矩阵（RC_bray）的修正Raup-Crick指数（RC_bray）的零值与观测值的偏差（零模型 = 999次排列）进一步表征了随机过程。RC_bray > 0.95 值表示扩散限制的比例，其中由于物种运动受限而导致群落相异；RC_bray < -0.95 值表示均质化扩散的比例，其中高度相似性源于广泛的扩散。最后，由此产生的非显著RC_bray值被认为是非主导的，因此表示漂变或非主导过程。分别对细菌和子囊菌门以及丰富和稀有类群数据集量化了群落构建过程。

3 结果

3.1 过去的农业活动未对土壤养分含量产生长期影响

正如先前报道的，地点之间土壤组成的主要差异主要归因于干湿循环的影响。这些循环使老农场和蒸发盆地点位的表土层硬化，导致更高的粘土含量（更高的铝比例）。本研究通过老农场（OF）和蒸发盆地（EB）地点较高的石灰岩和CaO含量进一步支持了这些观察结果。虽然过去的农业活动中可能施用了肥料，但目前的养分含量被发现非常低。具体而言，平均氮（μ = 0.23 mg kg^-1）、有机质（μ = 0.52 mg kg^-1）和有效磷（μ = 0.01 mg kg^-1）浓度在各地点间没有显著差异。平均而言，根际土壤呈高碱性（μ = 8.75 ± 0.54），在Nat 2和LR地点观察到最高值。令人惊讶的是，OF根际的pH值呈现双峰分布，其中八个样品的pH接近8，而五个样品的pH接近9。与自然地点Nat 1和Nat 2相比，来自OF和EB地点的根际土壤以富含Al、Fe、Mn和K为特征，但Mg和Si含量较低。

3.2 土地利用影响微生物组成和Alpha多样性

在各个地点，细菌群落主要由放线菌门（Actinobacteriota, μ = 29.7% ± 11.3%）、芽孢杆菌门（Bacillota, μ = 21.4% ± 16%）、绿弯菌门（Chloroflexi, μ = 18.4% ± 12.9%）和变形菌门（Proteobacteria, μ = 9.7% ± 4.2%）组成。子囊菌门（Ascomycota）表现出通常与沙漠土壤和根际相关的属，如曲霉属（Aspergillus, μ = 19.3% ± 16.4%）、青霉属（Penicillium, μ = 19.5% ± 18.5%）、瓶囊霉属（Pithoascus, μ = 3% ± 4.4%）、毛壳属（Botryotrichum, μ = 3.8% ± 5.5%）、Auxarthron属（μ = 5.5% ± 7.7%）以及高比例的未鉴定属（μ = 13.5% ± 14.5%）。真菌数据集的测序覆盖度高于细菌数据集，特别是在^q = 0时，表明稀有类群的表征对于真菌更为稳健。增加多样性阶数持续降低了细菌和真菌群落的有效谱系数。

对于细菌，无论丰度加权如何，自然环境（Nat 2）和蒸发盆地（EB）的系统发育多样性均低于老农场（OF, LR）。对于真菌，当平等权重赋予丰富和稀有类群时，在^q = 0时，老农场（OF）的多样性最高，而蒸发盆地（EB）的多样性最低。在群落水平上，硅、钾和锰在^q = 0时显著影响细菌多样性，而其他环境变量的影响可忽略不计。在^q = 1时，只有硅和钾对多样性有影响。在^q = 2时（关注更丰富的物种），pH和铁对细菌系统发育多样性表现出显著影响。对于真菌，钙在^q = 0时影响多样性，而铁在^q = 1和^q = 2时均对系统发育多样性产生负面影响。

通过关注生态位，恢复的农场（LR）拥有最宽生态位的细菌群落，而自然环境2（Nat 2，位于沙丘上部沙质基质中）支持具有较窄生态位的细菌群落。蒸发盆地（EB）拥有生态位最窄的细菌群落。对于整个真菌群落，未检测到生态位宽度的显著差异。然而，在子囊菌门内，最宽的生态位出现在恢复的农场（LR），而最窄的生态位出现在蒸发盆地（EB）。

3.3 Beta多样性的系统发育周转

微生物Beta多样性受过去土地利用的强烈影响，无论分析的是整个群落、丰富类群还是稀有类群。自然环境（Nat 1, Nat 2）形成了与老农场（OF, LR）和蒸发盆地（EB）明显分离的独特簇。与真菌群落相比，这种聚类模式在细菌群落中更为明显。

为了进一步探索地点之间Beta多样性的驱动因素并量化作为类群丰度函数的差异，我们进行了Beta多样性分区。对于细菌群落，丰富类群在每个地点内表现出更强的聚类，导致地点之间的Bray-Curtis相异性大于稀有类群。最强的相异性（红色边缘）出现在蒸发盆地（EB）和其他地点之间，而稀有类群表现出较弱的分化，如蓝色边缘所示。地点之间细菌Beta多样性的差异主要由丰度的平衡变化驱动，而不是丰度梯度。系统发育周转显示蒸发盆地（EB）和其他地点之间存在显著分化，特别是对于丰富类群。相反，嵌套性对这些差异的贡献最小。此外，丰富类群的S?rensen系统发育相异性始终高于稀有类群，突出了优势物种在驱动地点间系统发育差异中的突出作用。

对于真菌，Bray-Curtis相异性也揭示了跨地点的强聚类和分化，特别是对于丰富类群，稀有类群的差异不太明显。丰富和稀有真菌类群的系统发育相异性主要由周转驱动，尽管丰富类群的分化更强。嵌套性对真菌系统发育相异性的贡献最小，这与细菌群落的模式相似。值得注意的是，蒸发盆地（EB）和其他地点之间的系统发育周转对于细菌和真菌群落都是显著的。老农场（OF）和自然环境（Nat 1, Nat 2）之间的这种周转对于两个分类群更为显著。总体系统发育差异，通过S?rensen系统发育相异性测量，对于细菌和真菌的丰富类群都大于稀有类群，最显著的差异发生在蒸发盆地和其他地点之间。

在识别与各地点细菌和真菌Beta多样性相关的环境变量时，我们发现锰（Mn）和硅（Si）是细菌群落Bray-Curtis相异性的主要驱动因素。此外，钾（K）、铁（Fe）和pH表现出显著影响，特别是影响系统发育相异性，尤其是对于丰富类群。相反，真菌Bray-Curtis相异性主要由钾（K）和镁（Mg）驱动，而铝（Al）、铁（Fe）、钾（K）和pH是塑造系统发育相异性的主要因素。

3.4 干扰和沙漠非生物约束的系统发育信号

在第一个自然地点（Nat 1）以及老农场（OF）和恢复的农场（LR）观察到细菌群落的强烈系统发育聚类（NRI > 2），与第二个自然地点（Nat 2）和蒸发盆地（EB）相比。这种模式对于丰富的细菌类群是一致的，但与稀有类群形成对比，在Nat 2和LR检测到稀有类群的系统发育过度分散。相反，子囊菌门真菌群落表现出较低的系统发育聚类，跨地点无显著差异，特别是当考虑所有子囊菌门类群时。当使用关注更密切相关类群的最近分类单元指数（NTI）时，这种模式保持一致。然而，对于细菌，使用NTI时系统发育聚类也很明显（NTI > 2），与