太平洋树蛙声学性信号的谱系分化：从脉冲率差异看繁殖隔离形成机制

本文通过对太平洋树蛙（Pseudacris regilla）九种群的广告鸣叫（advertisement call）与线粒体细胞色素b（cytb）基因的联合分析，揭示了声学性信号差异与线粒体谱系（mitochondrial lineage）分化的紧密关联。研究发现脉冲率（pulse rate）和第一阶段脉冲数（phase 1 pulse count）在谱系间呈现显著分化（部分η2分别达0.81和0.57），且这种分化模式无法完全由地理距离或环境因素（isolation by environment）解释。作者提出，声学信号的谱系特异性分化可能通过脉冲计数神经元（interval-counting neurons）的调谐差异驱动繁殖前隔离（premating isolation），为理解两栖类物种形成提供了神经行为学新视角。

　　

引言：声学信号在物种形成中的作用

在进化生物学中，理解生物多样性产生和维持的因素是一个核心目标。性状变异、种群间性状分化以及后续的繁殖隔离是物种形成过程中的关键阶段。性选择驱动的性状分歧及其在物种形成中的相对贡献，在过去几十年中一直是研究热点。无论性选择压力在多大程度上驱动物种形成过程，性隔离长期以来被认为是种群间繁殖前隔离的最重要原因之一。

声学通讯信号在昆虫、鱼类、两栖类、鸟类和哺乳动物等广泛类群中调节交配行为。比较研究表明，声学信号变异可能在快速物种形成的谱系多样化中发挥重要作用，既能在物种形成早期促进繁殖隔离，也能在后期过程中强化隔离屏障。对种内变异的研究揭示，声学性信号的种群间差异普遍存在，并可能影响配偶识别。因此，对声学通讯依赖交配行为的物种开展声学信号和交配行为的种群间差异研究，有助于阐明多样化的阶段和驱动因素。

无尾两栖类是研究声学信号分化及其在繁殖隔离中作用的理想模型。在许多蛙类物种中，雄性产生的广告鸣叫既能吸引雌性，又能驱逐竞争对手。这些广告鸣叫通常既是物种识别所必需的，也是充分的。此外，许多无尾类的低扩散能力使它们容易在性性状上出现局部分化。

研究背景与目标

本研究以分类学尚未解决的太平洋树蛙（Pseudacris regilla）为研究对象。这种树蛙在北美西部广泛分布，从墨西哥的下加利福尼亚南部到加拿大的不列颠哥伦比亚省，海拔从海平面到3300米。重要的是，太平洋树蛙的分类学仍存在争议。先前基于线粒体DNA的系统发育分析支持存在三个物种：墨西哥和南加州的P. hypochondriaca、中北加州的P. sierra以及从俄勒冈州到加拿大的P. regilla。然而，基于核DNA的分析并不支持这种划分。

在繁殖季节，雌性太平洋树蛙根据雄性产生的声学性信号选择配偶。据我们所知，目前没有关于太平洋树蛙使用其他类型性信号（如化学、视觉）的报道。因此，对太平洋树蛙声学性展示和交配行为的地理变异模式的研究，可能有助于阐明该类群的分类学问题。

本研究的目标是表征广告鸣叫的地理变异模式，并确定鸣叫特性在线粒体谱系间变异是否大于谱系内变异。我们预测，如果交配鸣叫差异在线粒体谱系间的交配前行为隔离中起作用，那么谱系间的差异将大于谱系内差异，并且可能用于物种识别的鸣叫特性会出现阶跃式（而非渐变式）变异。

材料与方法

研究地点与样本采集

研究在加利福尼亚州的九个太平洋树蛙种群进行，这些种群代表了该物种分布范围内的地理和生态多样性。种群间成对距离从约100公里到约1050公里，海拔从近海平面到近2000米。所有声学和遗传数据都是在每个种群的繁殖季节夜间合唱活动高峰期收集的。

遗传数据分析

从成年雄性后腿采集趾剪样本，保存于95%乙醇中。使用QIAamp Fast DNA Tissue Kit提取基因组DNA。扩增线粒体细胞色素b（cytb）基因的609-bp片段，使用引物MVZ15和MVZ18。PCR产物经纯化后进行双向Sanger测序。使用最大似然法（ML）和贝叶斯推断（BI）进行系统发育分析，计算种群间的遗传距离。

声学记录与分析

使用TASCAM D-40手持录音机和Sennheiser ME-66麦克风录制雄性广告鸣叫的数字录音（44.1 kHz，16位分辨率）。从每个录音中选取一组四个连续的双相鸣叫，没有其他邻近雄性的重叠鸣叫。使用Raven Pro v1.5测量八个时间特性和一个频谱特性。所有时间特性在波形显示中测量，频谱特性在选择频谱显示中测量。

由于温度会影响脉冲和鸣叫的产生速率以及各阶段的持续时间，而主导频率与个体的吻肛长（SVL）负相关，因此将所有时间鸣叫特性标准化到14°C的共同温度，将鸣叫主导频率标准化到35毫米的共同SVL。

统计分析与系统发育重建

使用Pagel‘s λ检验声学性状的系统发育信号。为了确定鸣叫性状在线粒体谱系间和谱系内种群间的变异程度，进行了以谱系内嵌套种群的ANOVA分析。使用主成分分析（PCA）计算种群间的声学距离、环境距离和遗传距离。采用Mantel检验和偏Mantel检验来探究信号分化与遗传、地理和环境距离之间的关系。

结果：遗传变异模式

系统发育分析支持太平洋树蛙类群中存在三个主要支系。九个焦点种群分为北部的P. sierra支系（洪堡县、门多西诺县、塞拉县、莱克县、奥林达县）和南部的P. hypochondriaca支系（圣路易斯奥比斯波县、圣巴巴拉县、洛杉矶县、圣迭戈县）。这些支系的支持度很高，ML自举值≥85%，关键节点的后验概率≥0.95。

谱系间的遗传距离显著高于谱系内距离。例如，奥林达县和圣路易斯奥比斯波县之间的遗传距离为0.04125，而洪堡县和圣路易斯奥比斯波县之间的差异为0.04600。相比之下，谱系内的遗传距离较低，表明种群水平的遗传凝聚力高。

鸣叫在线粒体谱系间和谱系内的变异模式

研究发现脉冲率（λ = 0.992，p < 0.0001）和第一阶段脉冲数（λ = 0.684，p = 0.016）存在显著的系统发育信号。其他声学性状未检测到显著的系统发育信号（所有λ < 0.5；所有p > 0.13）。

嵌套ANOVA结果显示，线粒体谱系间差异最大的鸣叫特性是脉冲率（F_1,147 = 647.51，p < 0.0001，部分η2 = 0.81）和第一阶段脉冲数（F_1,147 = 198.77，p < 0.0001，部分η2 = 0.57）。谱系间在鸣叫主导频率和鸣叫持续时间上也存在显著差异，效应大小中等。在线粒体谱系内，种群间在相同的鸣叫特性上也存在显著差异（除第二阶段脉冲数外）。

遗传、地理、环境与声学距离的关系

对九个鸣叫特性进行的PCA分析揭示了三个特征值>1.0的主成分，共同解释了总方差的75%。PC1解释了30%的方差，主要在脉冲率上负载较重（负相关）。PC2解释了26%的方差，主要在鸣叫持续时间和各阶段持续时间上负载较重（负相关）。PC3解释了19%的方差，主要在第一阶段脉冲数和相间间隔上负载较重（负相关）。

研究发现遗传距离与地理距离在简单Mantel检验和偏Mantel检验中均显著相关。遗传距离与环境距离在使用简单Mantel检验时显著相关，但在控制谱系间和谱系内比较的偏Mantel检验中不显著。鸣叫距离与遗传距离在使用简单Mantel检验时显著相关，但在控制谱系间和谱系内比较时不显著。视觉检查表明，鸣叫距离与遗传距离在线粒体谱系内呈正相关，但在不同线粒体谱系的种群间没有显示正相关关系。

讨论：声学信号分化的意义

本研究结果证实了太平洋树蛙类群中先前报道的线粒体基因遗传结构，并显示我们的数据集跨越了太平洋树蛙三个线粒体谱系中的两个。这种模式反映了加利福尼亚其他类群的发现，包括Ensatina salamanders、太平洋蝾螈（Taricha）和加州红腿蛙（Rana draytonii），所有这些类群都显示出横跨加利福尼亚中部的深层遗传断裂，归因于沿海和内陆避难所的隔离。

重要的是，我们的声学分析揭示了太平洋树蛙广告鸣叫在线粒体谱系间的强烈差异，特别是在脉冲传递速率和脉冲数量方面。此外，我们的结果表明，广告鸣叫的差异最好由线粒体谱系来解释，而不是种群间的地理或环境距离。谱系间分化最大的声学特性——鸣叫中的脉冲数和脉冲传递速率——也表现出显著的系统发育信号，表明这些性状与历史谱系分裂协同进化。

支持遗传漂变作为声学信号进化驱动因素的证据是混合的。我们发现了遗传距离和地理距离之间的正相关关系。重要的是，我们发现在比较线粒体谱系内的种群时，遗传距离和交配鸣叫距离之间存在相关性。然而，来自不同线粒体谱系的种群比较并未显示遗传距离和鸣叫距离之间的正相关关系。此外，地理距离与交配鸣叫距离在线粒体谱系内或谱系间均不呈正相关。这些结果表明，随机因素（如漂变）不能完全解释太平洋树蛙声学性信号的进化。

我们的结果不支持太平洋树蛙中的环境隔离，因为在控制谱系间和谱系内比较时，我们没有发现遗传距离和环境距离之间的相关性。此外，在控制谱系间和谱系内比较时，交配鸣叫的分化与环境距离也不相关。这些结果表明，我们分析中包含的环境因素对太平洋树蛙的遗传分化和声学性信号的进化影响很小。

繁殖隔离的潜在机制

我们的研究结果显示，太平洋树蛙的声学性信号在南加州的“hypochondriaca”线粒体谱系与中北加州的“sierra”谱系之间存在强烈差异。早期对从加拿大到墨西哥更广地理范围的太平洋树蛙鸣叫变异的研究表明，中加州及以北种群的鸣叫与南加州和墨西哥的种群差异很大。在我们的研究中，主导频率在比较线粒体谱系时效应大小排名第三。早期研究没有包括我们研究中谱系间变异最大的两个特性：脉冲率和鸣叫第一阶段的脉冲数。

有趣的是，脉冲率和脉冲数已被认为是Pseudacris属及其他树蛙物种识别的重要特性。脉冲率在太平洋树蛙中是一种静态特性，静态鸣叫特性受到强烈的稳定化选择，并在物种识别中发挥作用。鉴于谱系间脉冲率的显著差异，雌性可能偏好自己谱系的鸣叫。如果这种偏好存在，即使在二次接触区，它们也可能维持谱系分化。

神经生物学视角

太平洋树蛙几十年来一直被用作无尾类听觉生理学研究的模型系统。对该物种首次识别出对物种特异性脉冲数响应的神经元——称为间隔计数神经元。这些“脉冲整合器”或“间隔计数”神经元现在已在几种蛙类中发现。重要的是，这些神经元对物种特异性脉冲率表现出强烈的选择性，引发反应所需的最小脉冲数因物种交配鸣叫中的脉冲数而异。这些神经元的调谐取决于兴奋性和抑制性输入的模式，我们开始了解这些神经元调谐特性差异背后的潜在遗传机制。

因此，谱系间鸣叫结构的差异可能反映（甚至驱动）神经调谐的差异，这可能是基于遗传的。这使得太平洋树蛙成为连接繁殖隔离的行为、神经和遗传机制的理想系统。

结论与展望

性信号无疑是维持繁殖前隔离最重要的性状之一。我们的研究增加了越来越多的例子，表明性信号的种群间变异不能完全用随机过程来解释。此外，我们在此表明，常用于物种识别的声学性信号特性在太平洋树蛙的线粒体谱系间差异很大。这种变异的原因和后果目前尚不清楚。未来研究应确定雌性太平洋树蛙在多大程度上区分不同谱系的鸣叫，调查介导谱系特异性偏好的声学特性，以及这些偏好的形状（如稳定化与定向性）和强度。了解这种变异的因果将有助于阐明促进太平洋树蛙多样化和分类学的进化力量。