印度尼西亚庞岸达兰海岸虾类弧菌污染研究：病原物种鉴定、毒素基因分析与水产健康管理意义

本研究系统分析了印度尼西亚西爪哇庞岸达兰海岸五个站点的虾类（凡纳滨对虾和斑节对虾）弧菌污染状况。通过TCBS培养基分离、革兰氏染色、PCR（聚合酶链反应）和基因测序，鉴定出副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）和溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus），并检测到毒素基因toxR，而tdh、trh、pirA和pirB基因为阴性。研究量化了弧菌丰度（最高达1.3767 × 106 CFU/g），揭示了弧菌与非弧菌的比例差异，并关联了弧菌存在与虾类红体病等临床症状。该研究强调了细菌和遗传监测对改善疾病监测、支持可持续虾类养殖的重要性。

　　

ABSTRACT

水生生物中的细菌感染对虾类养殖构成重大威胁，常导致生产损失。在庞岸达兰地区，为应对疾病爆发，经常采取提前收虾的做法。先前的研究已在五个站点的池塘水和沉积物中记录了弧菌和非弧菌，但对虾组织中的感染研究较少。本研究旨在鉴定凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）和野生斑节对虾（Penaeus monodon）中的致病性弧菌物种，检查毒素基因，并量化细菌丰度。从五个站点采集样本，并使用培养基、革兰氏染色和PCR进行分析。在站点1和5检测到副溶血性弧菌和溶藻弧菌，而站点2、3和4仅出现溶藻弧菌。站点1的弧菌丰度最高（1.3767 × 10⁶ CFU/g），站点3最低（0.009 × 10⁶ CFU/g），差异显著（p < 0.05）。除站点1外，非弧菌在大多数站点占主导地位。毒素基因分析显示部分分离株存在toxR，而tdh、trh、pirA和pirB缺失。这些发现强调了细菌和遗传监测对于改善疾病监测和支持可持续虾类养殖的重要性。

1 Introduction

水产养殖被认为是提供全球粮食安全和营养的重要产业。预计到2030年，其将贡献全球水生动物产量的60%以上。在众多水产养殖业中，虾类养殖因其高市场价值和相对较短的生产周期而备受关注。虾类养殖于20世纪80年代开始在东南亚沿海地区扩张，并在2007年在市场份额上超过野生捕捞虾。在东南亚，虾类对印度尼西亚、菲律宾、越南和泰国以及美洲的厄瓜多尔、墨西哥和巴西的经济做出了显著贡献。该行业仍在扩大规模，大部分生产发生在东亚、东南亚和拉丁美洲，主要消费市场为美国、欧盟和日本等发达市场。

虾是属于对虾总科的十足目甲壳动物，是全球商业渔业和水产养殖的重要资源，占全球甲壳类消费量的30%以上。20世纪80年代，通过增加池塘数量和养殖密度，以及生物技术进步提高了所有生产阶段的效率和质量，水产养殖得以发展。虾类产业的发展严重依赖于关键的健康管理方案。因此，水产养殖疾病通过导致虾产量下降而对该行业产生了重大影响。

弧菌属是一组经常与水产养殖业高死亡率和重大经济损失相关的细菌。迄今为止，已有近20种弧菌被确定为引起水生动物疾病的病原体。虾塘中的疾病爆发通常是多种因素复杂相互作用的结果，包括不良的环境条件、高养殖密度与管理不善相结合、应激、宿主免疫系统抑制以及细菌、病毒、真菌和寄生虫等传染源。影响虾类养殖的最具影响力的疾病之一是细菌感染，特别是弧菌病，已被确定为该行业成功和经济可持续性的主要威胁。

弧菌病由多种弧菌引起，包括哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌和霍乱弧菌，这些弧菌可感染虾并导致临床症状，如生长迟缓、存活率低、抗病力下降、嗜睡、尾部痉挛和游泳行为异常，特别是在低盐度条件下。这些感染通常导致大规模死亡，最终导致生产失败和许多亚洲国家的重大经济损失。

此外，弧菌已被确定为虾苗孵化场中的优势微生物，影响生殖周期并导致幼虾和成虾死亡。此外，虾还易受其他各种病原体的影响，包括白斑病毒和黄头病毒，这进一步损害了它们的健康，并对虾类养殖的可持续性构成了额外挑战。

庞岸达兰地区拥有91公里海岸线，拥有众多虾塘，为当地水产养殖和区域经济做出贡献。然而，尽管经常因疑似疾病而提前收虾，但这些养殖系统中的细菌感染研究仍然不足。弧菌尤其令人担忧，因为它们携带毒素基因，如tdh、trh、pirA、pirB和toxR，这些基因在毒力中起关键作用。检测这些基因对于评估致病潜力和疾病风险至关重要。本研究旨在鉴定五个沿海站点的细菌种类、丰度和毒素基因存在情况，为健康管理和预防策略提供基础。

2 Materials and Methods

2.1 Study Location

研究在庞岸达兰地区南部海岸五个代表不同虾类养殖系统的站点进行。站点1位于Kertamukti村，为半集约化虾塘。站点2和3位于Legok Jawa村，站点2为半集约化养殖系统，站点3为集约化虾塘。站点4位于Madasari村，采用集约化养殖系统。站点5位于Kalipucang区Bagolo村的Karapyak海滩沿岸水域，作为对照站点，无虾类养殖活动。选择这些地点是为了比较半集约化、集约化虾类养殖系统与未受水产养殖影响的自然海岸环境之间的条件。

2.2 Sample Collection

于2024年6月和7月随机从五个站点采集凡纳滨对虾和斑节对虾样本。每个站点采集5-10尾虾进行常规检查。样本处理后，置于含有无菌海水和甘油的无菌容器中，冷藏运送至实验室进行微生物学分析。

2.3 Procedure Isolation, Culture, and Characteristics of Typical Colonies of Vibrio spp.

使用硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖（TCBS）琼脂进行弧菌分离。样本稀释后接种于TCBS平板，37°C培养24小时。典型菌落（黄色或绿色）被计数并转接至营养肉汤（NB）中进一步培养，用于分子分析。所有程序遵循ISO 21872-1:2017和ISO 21872-2:2007国际标准。

2.4 Identification of Vibrio by Molecular Testing

使用Wizard Genomic DNA Purification Kit提取DNA。PCR使用针对16S rRNA基因和gyrB基因的特异性引物。PCR产物通过电泳验证，并进行DNA测序。序列使用BioEdit和MEGA11软件进行分析，并通过BLAST和系统发育分析进行物种鉴定。

2.5 Determination of Toxin Gene

使用特异性引物通过PCR检测tdh、trh、toxR、pirA和pirB毒素基因。反应体系总体积50μL，在MJ Mini Thermal Cycler上进行扩增。产物通过琼脂糖凝胶电泳显影。

2.6 Gram Staining and Colony Morphology Observations

进行革兰氏染色以基于细胞壁特性对细菌进行分类。在TCBS培养基上观察并记录菌落形态（形状、边缘、隆起、颜色、质地）。

2.7 Enumeration of Vibrio Bacterial Abundance

使用公式计算总弧菌数（TVC）和总平板计数（TPC），以评估样本中的弧菌数量。

2.8 Proportional Assessment of Vibrio and Non-Vibrio Bacteria in Shrimp

通过比较TCBS（选择性）和NA（非选择性）培养基上的菌落计数，计算弧菌和非弧菌的比例。

2.9 Statistical Analysis

使用ANOVA比较不同站点间的细菌丰度差异，若方差不齐则使用Brown-Forsythe或Welch ANOVA。事后分析使用Tukey HSD。所有分析使用IBM SPSS Statistics 27进行。

3 Result

从五个站点采集的虾细菌样本在选择性培养基上生长，革兰氏染色显示为革兰阴性、逗号形细菌，菌落呈绿色和黄色。选择代表性菌落（基于颜色变化）进行PCR和测序分析。

PCR扩增16S rRNA和gyrB基因的电泳结果显示，所有样本的16S rRNA基因扩增成功，gyrB基因在大多数样本中也成功扩增（S3样本较弱）。测序和BLAST分析鉴定出两种主要弧菌：溶藻弧菌（S2, S3, S4）和副溶血性弧菌（S1, S5）。gyrB基因的序列相似性（96.71%–99.05%）高于16S rRNA基因（94.55%–98.94%），表明gyrB在区分弧菌属物种方面更敏感、准确。系统发育树分析进一步支持了这一鉴定结果。

毒素基因检测显示，在测试的五个基因中，仅toxR基因呈阳性（在S1, S3, S5中检测到）。tdh、trh、pirA和pirB基因在所有分离株中均未检测到。这表明所鉴定的菌株并非与人类肠胃炎相关的临床类型或导致AHPND的菌株，但toxR基因的存在表明其仍具有潜在的毒力。

TVC分析显示，站点1的弧菌丰度最高（1.3767 × 10⁶ CFU/g），站点5次之（1.0043 × 10⁶ CFU/g），站点3最低（0.009 × 10⁶ CFU/g）。ANOVA表明站点间细菌丰度存在显著差异（p < 0.05）。弧菌与非弧菌比例评估显示，站点1的弧菌占主导地位（81.86%），而站点2、3、4则以非弧菌为主（99.46%–99.82%）。

根据庞岸达兰地区渔业和海洋事务部的报告，虾塘中出现了由弧菌引起的五种细菌性疾病，包括AHPND、IMNV、WSSV、WFD、SHND和红体病。在站点1观察到虾体出现红色变色、行动迟缓等红体病临床症状。其他站点的虾未发现明显的健康问题。

4 Discussion

TCBS琼脂因其对弧菌的选择性而被使用。通过针对保守基因16S rRNA和gyrB的PCR进行物种鉴定，确保了快速准确的结果。毒素基因检测用于评估分离株的毒力潜力。

弧菌是革兰阴性细菌，在高盐度环境中繁殖。已知超过140种弧菌，其中12种对人类致病，16种能感染水生动物。感染通常在宿主因环境波动而应激时发生。

本研究结果与先前庞岸达兰环境监测数据相结合，表明沉积物是致病性弧菌的储存库，而直接从虾组织分离则揭示了活跃定植于宿主的菌株。例如，在站点4沉积物中检测到的溶藻弧菌也在本研究的虾组织中被分离出来，但未出现临床症状，可能由于亚临床感染或养殖管理有效。而在站点1，虾组织中副溶血性弧菌的存在与周围水体和沉积物中先前报告的高营养负荷以及本研究中出现的疾病症状相吻合，突出了弧菌环境储存库、水质与虾类活动感染之间的潜在联系。

在站点1鉴定出的副溶血性弧菌与虾的红体病症状相关。该病的临床症状（尾扇、尾节、鳃部变红）与本研究的现场观察一致。毒素基因检测仅发现toxR基因，而缺乏pirA/pirB基因，排除了AHPND的可能性，但toxR基因作为毒力因子主要调节器的作用与红体病的发病机制相关。环境因素如水质差、低氧、高密度养殖等加剧了疾病表现。

站点1的高弧菌丰度和主导地位与其不良水质（氨氮、硝酸盐、磷酸盐超标）相关，这种富营养化环境促进了弧菌繁殖。站点2、3、4虽然检测到溶藻弧菌，但弧菌丰度低，虾体健康，可能与使用益生菌和良好水质管理有关。站点5的野生斑节对虾中检测到副溶血性弧菌但无病症，可能与其在自然环境中更强的免疫反应有关。

尽管虾产量总体增长，但致病性弧菌的持续存在对可持续性构成挑战。需要采取综合健康管理措施，包括严格的生物安全、感染虾的安全处理、持续疾病监测和防止交叉污染。维持水质、降低养殖密度、减少环境应激和确保充足营养对于最小化感染风险和支持长期池塘生产力至关重要。

5 Conclusion

本研究证明了庞岸达兰五个海岸站点凡纳滨对虾和斑节对虾中弧菌和非弧菌的存在。鉴定出的弧菌物种（副溶血性弧菌和溶藻弧菌）疑似与红体病相关，其中站点1（Kertamukti）的弧菌 dominance 最高，凡纳滨对虾出现临床症状导致提前收虾。相比之下，站点5（Karapyak）的野生斑节对虾尽管携带弧菌但仍保持健康。毒素基因分析仅检测到toxR基因，表明分离株非人类致病性或AHPND致病型，但toxR的存在提示了与虾类感染相关的潜在毒力。这些发现为环境评估和制定减少庞岸达兰虾类养殖中弧菌污染的缓解政策提供了重要基础。需要加强合作实施缓解策略以支持虾类生产的可持续性。