枯草芽孢杆菌动力样蛋白DynA通过膜结合介导细菌抗噬菌体免疫的分子机制解析

本研究揭示了枯草芽孢杆菌动力样蛋白DynA通过其D1亚基中由带电赖氨酸（K360/K367）和疏水苯丙氨酸（F363/F364/F365）残基构成的膜结合结构域，介导细菌膜结合并形成抗噬菌体防御屏障的分子机制。突变实验证实该位点缺失会导致膜结合能力丧失和噬菌体敏感性显著增加，为细菌天然免疫系统提供了关键结构功能依据。

　　

引言

动力蛋白超家族是一类在膜动力学过程中起关键作用的大型GTP酶。枯草芽孢杆菌动力样蛋白A（DynA）作为一种双头细菌动力样蛋白（BDLP），具有膜结合和膜栓系功能。研究表明DynA在响应孔形成抗生素和噬菌体时能在细菌膜上形成大型簇状结构，暗示其在维持膜完整性方面的重要作用。本研究聚焦于DynA蛋白D1亚基中的膜结合位点，该区域包含带正电荷的赖氨酸残基K360和K367以及疏水苯丙氨酸残基F363、F364和F365。

膜结合位点的发现与验证

通过AlphaFold v2.0模型分析，发现DynA的D1亚基末端存在一个由带正电荷和疏水残基组成的潜在膜结合区域。该区域位于D1亚基延伸的茎部末端，而D2亚基中缺乏类似结构。为验证这一位点的功能，研究团队构建了三种突变体：非保守替换突变体DynA F363A/F364A/F365A和DynA K360A/K367A，以及保守替换突变体DynA F363W/F364W/F365W。所有蛋白均在大肠杆菌中异源表达并纯化，保留了基础GTP酶活性，表明蛋白整体结构完整性。

脂质体沉降实验显示，野生型DynA和保守替换突变体能有效结合脂质体，而非保守替换突变体完全丧失膜结合能力。透射电镜观察进一步证实：野生型DynA能包裹脂质体并引发聚集，而突变体则无法与膜结构结合，其中K360A/K367A突变体甚至引起脂质体降解。

膜结合在噬菌体防御中的关键作用

通过构建表达不同DynA变体的枯草芽孢杆菌菌株，研究团队分析了Φ29噬菌体感染过程中的细胞裂解行为。表达膜结合缺陷突变体（F363A/F364A/F365A和K360A/K367A）的菌株表现出与DynA缺失菌株相似的高敏感性，噬菌斑更大且数量增多。相反，表达保守替换突变体（F363W/F364W/F365W）的菌株则保持与野生型相当的抗性。

进一步实验表明，单独表达D1亚基即可提供噬菌体抗性，而D2亚基无此功能。当D1亚基中引入F363A/F364A/F365A突变后，其保护作用完全丧失。这些结果证明DynA的噬菌体防御功能依赖于D1亚基的膜结合能力。

讨论与机制解析

DynA作为细菌天然免疫系统的重要组成部分，通过形成物理屏障延缓噬菌体诱导的宿主细胞裂解。其作用机制与真核生物Mx动力蛋白的抗病毒功能具有相似性，但DynA直接作用于细胞膜而非病毒颗粒。与其他细菌动力蛋白（如结核分枝杆菌IniA和大肠杆菌LeoA）主要参与膜分裂和囊泡释放不同，DynA从细胞质侧结合膜结构，可能通过捕获噬菌体后代阻止其扩散。

研究首次明确了DynA膜结合位点的具体残基组成，揭示了正电荷与疏水相互协同的作用模式。这种结构特征与Nostoc punctiforme BDLP的桨状域具有相似性，表明细菌动力蛋白在膜结合机制上的保守性。

材料与方法

实验使用枯草芽孢杆菌168及其衍生菌株，Φ29噬菌体从DSMZ获取。蛋白纯化采用Ni-NTA亲和层析和尺寸排阻色谱，GTP酶活性使用EnzChek磷酸检测试剂盒测定。膜结合实验使用400nm大单层囊泡（LUV），通过超速离心分离结合与未结合蛋白。电镜样品采用甲基纤维素-醋酸铀负染技术处理。

噬菌体感染实验采用MOI=1的感染复数，通过实时监测OD600评估裂解程度。噬菌斑分析采用双层琼脂法，统计采用SPSS软件进行ANOVA和Tukey HSD检验。

结论

本研究通过结构生物学、生物化学和微生物学方法，证实了DynA D1亚基中由K360、K367、F363、F364和F365残基组成的膜结合位点对其抗噬菌体功能的关键作用。这一发现不仅阐明了细菌动力样蛋白在天然免疫中的分子机制，也为开发新型抗菌策略提供了理论依据。