嗜热栖热菌中赖氨酸生物合成酶底物特异性揭示赖氨酸与精氨酸生物合成的进化关系

本综述通过探究嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）中赖氨酸生物合成酶（如LysZ和LysY）对精氨酸中间体的交叉催化活性，揭示了其底物宽泛性及进化起源。研究证实了氨基酸载体蛋白（AmCP）介导的原始双功能通路的存在，为代谢途径 specialization 和酶 promiscuity 的进化策略提供了关键见解，对理解生命早期代谢网络的演化具有重要意义。

　　

摘要

代谢途径被认为起源于具有广泛底物特异性的祖先酶，随后才分化为专门化的路线。嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）拥有一个不寻常的氨基酸载体蛋白（AmCP）介导的赖氨酸生物合成途径，以及一个典型的精氨酸生物合成途径。尽管每条途径被认为对其相应的氨基酸具有特异性，但若干赖氨酸生物合成酶已被证明可以接受精氨酸中间体。本研究调查了[LysW]-氨基己二酸激酶（LysZ；EC:2.7.2.17）和[LysW]-L-2-氨基己二酸-6-磷酸还原酶（LysY；EC:1.2.1.103），它们分别是在利用氨基载体蛋白LysW（AmCP）将α-氨基己二酸（AAA）转化为赖氨酸的过程中的第二步和第三步反应的催化酶，旨在明确它们的特异性与进化起源。

引言

生物适应以及从简单到复杂生命形式的转变与氨基酸代谢途径的进化密切相关。在20种蛋白质氨基酸中，几种生物合成途径是由从共同祖先进化而来的酶催化的。在细菌中，精氨酸生物合成途径通常始于谷氨酸α-氨基的乙酰化。精氨酸生物合成中的后续步骤包括磷酸化、还原、转氨基以及从α-氨基上移除保护性乙酰基。精氨酸途径中的ArgB、ArgC和ArgE酶与赖氨酸生物合成的二氨基庚二酸（DAP）途径中的LysC、Asd和DapE酶具有结构相似性，并且催化类似的化学反应。此外，精氨酸生物合成中的ArgD在大肠杆菌（Escherichia coli）中是一种双功能酶，在赖氨酸生物合成中作为DapC起作用。这些发现表明赖氨酸和精氨酸生物合成之间存在进化上的联系。

嗜热栖热菌中的赖氨酸生物合成途径是一个重要的例子。在该途径的后半部分，α-氨基己二酸（AAA）通过其α-氨基加载到名为LysW的氨基载体蛋白（AmCP）上，随后在AmCP上发生的反应与精氨酸生物合成途径的反应类似。AmCP介导的赖氨酸生物合成途径也被证明在某些微生物中参与鸟氨酸和/或精氨酸的生物合成。超嗜热古菌 Thermococcus kodakarensis 拥有一套AmCP介导途径的酶，能够利用AAA和谷氨酸（Glu）作为底物分别合成赖氨酸和鸟氨酸。类似地，在硫化叶菌属（Sulfolobus）中，AmCP介导的赖氨酸生物合成中的大多数酶在精氨酸生物合成中作为双功能酶起作用，除了LysX和ArgX，它们分别在AmCP介导的赖氨酸和精氨酸生物合成中催化将AAA和谷氨酸加载到AmCP上的反应。LysX和ArgX是旁系同源酶，推测它们是从一个具有类似 Thermococcus kodakarensis 中LysX/ArgX那样的双功能性的共同祖先酶进化而来。这些发现强有力地表明赖氨酸和精氨酸生物合成途径共享一个共同的祖先途径。

AmCP介导的途径可能代表了这些途径中最早期的进化发展，这支持了“拼凑”假说，即早期生命形式拥有最简基因组并依赖多功能酶来执行 diverse 生化反应。值得注意的是，在盐古菌 Natrinema gari 中，赖氨酸是通过DAP途径生物合成的，而精氨酸则是通过一个ArgW（精氨酸生物合成中LysW的同源蛋白）介导的途径生物合成的。因此，对AmCP介导的赖氨酸和精氨酸生物合成途径的研究为探究进化压力如何引导这些途径在不同形式中专化与保留提供了一个极好的模型，从而满足不同的生化需求并通过代谢途径的多样化促进对不同环境的适应。

嗜热栖热菌拥有赖氨酸和精氨酸生物合成途径：AmCP（LysW）介导的赖氨酸生物合成和典型的带有N-乙酰修饰的精氨酸生物合成。然而，负责LysW介导的赖氨酸生物合成途径最后两步的转氨酶（LysJ）和水解酶（LysK）显示出能够催化典型精氨酸生物合成中的类似反应，该反应使用少一个亚甲基的带有N-乙酰修饰的底物。这一发现表明了嗜热栖热菌当前赖氨酸生物合成途径中酶的底物宽泛性（promiscuity）。与之对比，硫化叶菌中的LysX和ArgX分别只将AAA和谷氨酸加载到AmCP上，成为决定该途径合成赖氨酸还是鸟氨酸的关键决定因素。嗜热栖热菌中其余赖氨酸生物合成酶LysZ和LysY的底物特异性尚待研究。因此，对这两种酶底物特异性的进一步研究将为了解酶宽泛性以及嗜热栖热菌中赖氨酸/精氨酸生物合成途径的进化提供见解。

结果

设计具有生产LysW-Glu活性的LysX变体

为了研究LysZ和LysY在精氨酸生物合成中发挥功能的潜力，有必要制备LysW-Glu，它是AmCP介导的精氨酸生物合成中一个可能的中间体。由于来自嗜热栖热菌的LysX已被证明对识别AAA作为底物表现出严格的特异性，我们需要改变LysX的底物特异性，使其趋向于ArgX或能有效识别谷氨酸作为底物的LysX/ArgX型双功能酶。基于我们先前对嗜热栖热菌LysX、专精于精氨酸生物合成的硫化叶菌（Sulfolobus acidocaldarius）ArgX、以及在赖氨酸和精氨酸（鸟氨酸）生物合成中均起作用的 Thermococcus kodakarensis 双功能LysX/ArgX的结构分析和序列比较，我们提出了一个由五个氨基酸残基组成的特征 motif，它影响LysX相关蛋白的底物特异性。

我们通过用来自单功能ArgX或双功能LysX/ArgX的相应残基替换该特征 motif 中的残基，构建了18个LysX变体。为了检查5氨基酸特征 motif 中的替换如何影响底物特异性，我们通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）监测产物LysW-AAA和LysW-Glu，测量了每个变体将LysW与AAA或谷氨酸结合的活性。尽管我们之前仅检测到LysX将谷氨酸与LysW结合的痕量活性，但过夜反应导致鉴定出LysW-Glu，其转化率至少比LysW-AAA低10倍。所有在182、192、203和258/259位点的单点变体都保留了将天然底物AAA与LysW结合的能力；然而，携带单点替换F182I的LysX1变体也能将谷氨酸加载到LysW上。在构建的18个变体中，带有I192Y、T203V和N258G/S259F替换的LysX15变体（预期会产生更小、更疏水的结合口袋）对谷氨酸的活性增强最多，同时对更大底物AAA的活性降低。5氨基酸特征 motif 中氨基酸替换的影响是复杂的，不同程度地显著影响了LysX的底物特异性。

体内制备LysW-Glu

由于上述体外过夜反应中没有变体能完全将LysW转化为LysW-Glu，我们尝试在共表达LysW和具有高谷氨酸活性的LysX变体（LysX1、LysX6和LysX15）的大肠杆菌（E. coli）细胞中生产LysW-Glu。在补充有5 mM谷氨酸的2xYT培养基中培养重组大肠杆菌细胞后，通过阴离子交换色谱纯化LysW衍生物，并进行LC-MS分析。结果表明，LysX1、LysX6和LysX15变体成功地将大部分LysW转化为LysW-Glu。并行地，使用共表达LysW和野生型LysX的大肠杆菌细胞在补充有5 mM AAA的类似培养中生产LysW-AAA，转化率接近100%。

LysZ的双功能性：对潜在精氨酸生物合成的见解

LysZ利用ATP磷酸化LysW-AAA中AAA部分的羧基，形成LysW-AAA磷酸（LysW-AAAP）。基于LysW-Glu和LysW-AAA之间仅差一个碳单元的结构相似性，预计LysZ会表现出宽泛的活性以识别LysW-Glu和LysW-AAA，类似于LysJ和LysK。通过监测LysW-Glu/AAA经磷酸化随后与羟胺进行羟肟酸衍生物化后在tricine SDS-PAGE上的条带迁移，我们评估了LysZ对LysW-Glu的活性。结果表明，野生型LysZ催化LysW-Glu的磷酸化以及LysW-AAA的磷酸化；然而，对LysW-Glu的活性略低（约60%）于对天然底物LysW-AAA的活性。LysW-AAAP和LysW-GluP的形成通过LC-MS检测它们的羟肟酸衍生物得到了进一步验证。

LysY在精氨酸合成中的催化潜力

LysY催化LysW-AAAP的NADPH依赖性还原，生成LysW-AAA半醛（LysW-AASA），这是在赖氨酸生物合成中继LysZ反应之后的步骤。由于制备不稳定的反应性磷酸盐LysW-AAAP存在困难，LysY的活性通过在70°C高温下使用LysZ-LysY耦合测定法来测量，通过监测340 nm处NADPH吸光度的降低来评估。当添加Lys-Glu或Lys-AAA作为初始底物时，观察到了明显的NADPH氧化。以LysW-Glu作为初始底物时，NADPH的氧化显著低于以LysW-AAA为底物时。然而，重要的是要注意这是与LysZ的耦合反应。观察到的NADPH氧化活性的显著降低是LysZ和LysY对LysW-Glu衍生物活性降低的总和。LC-MS分析证实了LysW-AASA和LysW-谷氨酸半醛（GluSA）的形成，它们是LysZ和LysY耦合反应的预期产物；然而，产生的LysW-GluSA量较低。

LysZ和LysY宽泛性的生物信息学研究

LysZ和LysY对LysW-Glu衍生物的宽泛活性进一步支持了这样的假设：LysW介导的赖氨酸生物合成是从一个双功能的赖氨酸/精氨酸生物合成系统进化而来的。为了检验这些同源酶的进化关系，我们构建了两个系统发育树：一个是以天冬氨酸激酶作为外群的LysZ家族酶，另一个是以天冬氨酸半醛脱氢酶作为外群的LysY家族酶。

LysZ和LysY的系统发育树彼此相似，显示出相似的总体拓扑结构，仅在特定进化枝中观察到差异。嗜热栖热菌LysZ和LysY的一些最近亲缘是来自耐辐射奇球菌（Deinococcus radiodurans）赖氨酸生物合成中的直系同源物。在LysZ家族酶的系统树中，Deinococcus-Thermus进化枝与一个LysZ样酶共享一个共同祖先，这个酶可能被称为ArgZ，在盐古菌中发现的利用AmCP介导系统的精氨酸生物合成中起作用，这一点在LysZ系统发育中得到了强有力的支持（ bootstrap 值为93%）。相比之下，LysY系统发育中相应的节点的 bootstrap 支持率为46%。尽管尝试了各种构建系统发育树的方法并测试了不同的进化模型，但此处的拓扑结构保持稳定，表明LysY存在一些与LysZ不同的进化波动。尽管如此，这些结果与LysZ和LysY的宽泛酶活性一致，从而支持了这样的假设：耐辐射奇球菌和嗜热栖热菌中的LysW介导的赖氨酸生物合成起源于并进化自一个假设的双功能酶祖先1（ancestor 1），它推测参与赖氨酸和精氨酸两者的生物合成。

这一假设进一步得到祖先2（ancestor 2）分化为 Deinococcus-Thermus 节点的支持，该节点包含了能够识别LysW-AAA和LysW-Glu的双功能酶。此外，祖先2和典型精氨酸生物合成酶ArgB源自一个更遥远的共同祖先。对于LysY系统树可以得出相同的结论，其中LysY和一个LysY样酶（可能称为ArgY，用于盐古菌中利用AmCP介导系统的精氨酸生物合成）与能够识别LysW-AAAP和LysW-GluP的双功能酶共享一个祖先。

基于我们对LysZ和LysY的系统发育分析，以及先前对LysJ、LysK和LysX的研究，提出了一个赖氨酸和精氨酸生物合成途径的进化模型。祖先系统可能包括具有广泛特异性的LysW依赖性酶，能够处理LysW-AAA和LysW-Glu。一个早期的基因复制事件产生了该途径的两个旁系同源拷贝。在一个谱系中，一个拷贝向专一识别N-乙酰谷氨酸分化，产生了典型的精氨酸生物合成路线，而另一个要么保留了双功能性，要么后来特化为仅识别LysW-AAA或LysW-Glu，尽管具有不同程度的残留底物宽泛性。

讨论

本研究进行的深入分析揭示，LysX识别AAA作为优选底物，但对谷氨酸表现出可测量的活性，不到其对AAA活性的10%。然而，由于此活性太低，无法制备足够量的LysW-Glu用于分析LysZ和LysY识别LysW-Glu的能力，我们在LysX的由五个氨基酸残基组成的特征 motif 中引入了氨基酸替换，采用各种组合，并观察到了底物特异性的转变。带有F182I的LysX1变体对谷氨酸的活性增加，形成LysW-Glu的活性与保留的对LysW-AAA的活性相似。带有额外替换I192Y和T203V的LysX6变体对谷氨酸表现出强活性，对AAA的活性略有降低。这一结果证明了192和203位残基在评估AAA和谷氨酸的底物偏好中的关键和协同作用。其中，带有I192Y、T203V、N258G和S259F替换的LysX15表现出对谷氨酸的最高活性，并对AAA的活性显著降低。相比之下，拥有ArgX型酶特征的所有氨基酸残基的LysX7变体显示了对两种底物活性的显著丧失，表明182和258/259位残基的同时突变在LysX框架中产生了空间位阻，导致活性降低。

如上所述，AmCP介导的赖氨酸和精氨酸生物合成途径推测是从一个用于赖氨酸和精氨酸两者生物合成的双功能酶系统分化而来的。在这样一个双功能酶系统中，最终产物的浓度必须根据细胞中AAA或谷氨酸的浓度来确定。由于大多数氨基酸的氨基是从谷氨酸转移而来的，细胞中AAA的基础浓度必定低于谷氨酸。因此，在单一的赖氨酸/精氨酸双功能生物合成系统中，谷氨酸是AAA用于赖氨酸生物合成的一个不可避免的竞争性抑制剂。因此，可能需要一个赖氨酸特异性的生物合成系统来响应环境变化并诱导立即的赖氨酸生物合成。在嗜热栖热菌中，在双功能酶的基因复制之后，一个仍然使用AmCP系统用于AAA的氨基修饰，而另一个发展为使用乙酰基用于谷氨酸的氨基修饰。由于LysX对AAA的特异性是赖氨酸生物合成的关键因素，进化压力可能有利于增强对AAA的特异性并降低对谷氨酸的活性，从而形成了嗜热栖热菌中LysX的当前形式。

在本研究中，我们表征了LysZ和LysY的底物特异性，发现这些酶对LysW-AAA和LysW-Glu衍生物均表现出宽泛的活性，后者是精氨酸生物合成中潜在的底物。这一结果表明，嗜热栖热菌中的赖氨酸生物合成途径必定起源于一个涉及赖氨酸和精氨酸/鸟氨酸生物合成的双功能AmCP介导途径。值得注意的是，LysZ对LysW-Glu的活性约为其对天然底物LysW-AAA活性的60%，而LysZ和LysY的联合活性估计对LysW-GluP的活性约为其对天然底物LysW-AAAP活性的10-15%；然而，这些酶在相同的环境下进化。LysZ的宽泛活性超出了宽泛活性的通常范围（通常代表不到天然反应速率的1-10%）。有观点提出，宽泛活性的水平可能各不相同，如果该活性没有不利影响，酶可能偶然表现出强的宽泛活性。LysZ可能受到可忽略或没有选择压力来专化于赖氨酸生物合成并丧失其对LysW-Glu的活性，因为进化后的LysX没有产生足够量的LysW-Glu来影响赖氨酸生物合成。

嗜热栖热菌拥有一个典型类型的精氨酸生物合成途径。作为一种极端微生物，嗜热栖热菌依赖精氨酸来产生独特的支链多胺。这些化合物对于在极端高温环境下稳定核酸构象和保护它们免于脱嘌呤至关重要。值得注意的是，这些独特的多胺在极高温度（如80°C）下生长的细胞中含量丰富，但在较低温度（如65°C）下生长的细胞中含量较少。类似的支链多胺需求在超嗜热古菌 Thermococcus kodakarensis 中也有报道。缺乏支链多胺生物合成基因的 Thermococcus kodakarensis 突变体的生长温度上限降低了。此外， Thermococcus kodakarensis 的RNA聚合酶在体外高于80°C的温度下，在缺乏支链多胺时表现出较低的转录活性。因此，支链多胺生物合成对于在极端高温或超嗜热环境中的关键细胞事件是不可或缺的。嗜热栖热菌可能获得了典型的精氨酸合成途径来生产大量精氨酸并精细调控其生物合成。新获得的精氨酸生物合成增强了在极端高温条件下的适应度，从而促进了其生态位的扩展。尽管LysZ和LysY以及LysJ和LysK的宽泛活性可能是双功能生物合成系统的残留，但我们推测这些特性可能有利于将当前的赖氨酸生物合成途径重新进化回赖氨酸/精氨酸双功能生物合成途径，从而在需要时支持高水平的多胺生产。

结论

本研究揭示了嗜热栖热菌赖氨酸生物合成途径中酶的宽泛活性。所获得的结果支持了“拼凑”假说，表明AmCP介导的生物合成途径代表了一条早期的、原始的、用于缓慢和小规模合成赖氨酸和精氨酸的路线，并提供了对自然所采用的使代谢途径专化与扩展以及调整酶宽泛性的进化策略的更详细理解。对酶在生物合成途径中进化机制的进一步研究将最终增强我们为工业和医学应用改造酶和代谢途径的能力，并也有助于揭示生命起源和多样性的奥秘。