巴西白肩喷鴷（Pyriglena leucoptera）中新发现的诺维虫亚属（Novyella）疟原虫新种：形态学与分子系统学整合分类研究

本研究首次报道并描述了一种感染巴西白肩喷鴷（Pyriglena leucoptera）的疟原虫新种——Plasmodium (Novyella) pyriglenae sp. nov.。通过形态学（吉姆萨染色血涂片）与分子系统学（cytb基因序列分析）的整合分析，揭示了该物种与近缘种P. homopolare存在4.18%的遗传分化，并具有独特的形态特征（如四裂殖子型裂殖体及侧位滋养体）。该发现对理解禽疟原虫（Haemosporida）的生物多样性及宿主-寄生虫协同进化具有重要意义。

　　

ABSTRACT

鸟类疟原虫（Plasmodium, Haemosporida: Plasmodiidae）是全球分布的血孢子虫，包含50多个已描述物种，分为5个亚属。其中诺维虫亚属（Novyella）含22个形态种，仅59%与遗传谱系关联。本研究在巴西白肩喷鴷（Pyriglena leucoptera）中发现并描述了一种诺维虫亚属疟原虫新种。分子分析显示该新种与谱系PYLEU01关联，与Plasmodium homopolare遗传相似度为95.82%（分化度4.18%），但其形态特征存在显著差异：具大量成熟阿米巴样滋养体、幼龄裂殖体位于红细胞核侧位，且成熟裂殖体含较少裂殖子（以4个为主）。新种形态近似P. vaughani和P. rouxi，但可通过裂殖子数量（P. vaughani无4裂殖子特征，P. rouxi无5-6裂殖子特征）区分。整合分析表明该物种是诺维虫亚属中一个独立的新种。

1 Introduction

禽疟原虫（Haemosporida: Plasmodiidae）是一类广泛分布于温带和热带地区的寄生虫，由蚊科（Culicidae）昆虫传播。感染可导致野生鸟类生存和繁殖能力下降，甚至引发种群衰退（如夏威夷鸟类灭绝事件）。疟原虫属分为5个亚属：Haemamoeba、Giovannolaia、Novyella、Huffia和Bennettinia。目前全球仅50余种禽疟原虫可通过形态特征鉴定，但遗传谱系超过1300种，形态与分子数据的关联仍严重不足。诺维虫亚属是分子特征研究最充分的类群，59%的形态种已关联遗传谱系。本研究通过形态与分子整合分类方法，描述了感染白肩喷鴷的诺维虫新种，并探讨其与南美洲其他诺维虫种的系统发育关系。

2 Materials and Methods

2.1 Sampling Procedures

2022年4月，在巴西米纳斯吉拉斯州弗洛雷斯塔尔市（19°53′18.93″S, 44°24′40.61″W）的次生半落叶林中使用雾网捕获一只成年雌性白肩喷鴷。通过肱静脉穿刺采集血液样本（小于体重1%），保存于滤纸用于DNA提取。采样遵循巴西鸟类保护中心（CEMAVE）协议，并获得SISBIO（No. 81134-1）和动物伦理委员会（CEUA-UFMG No. 198/2022, CEUA-UFV No. 03/2018）许可。

2.2 Microscopic Examination of Blood Films

制备血涂片，用甲醇固定，吉姆萨染液（pH 7.2）染色70分钟。使用奥林巴斯CX31显微镜及成像系统观察，以1000倍放大扫描血涂片。寄生虫血症强度通过计数10000个红细胞中感染细胞的比例确定。形态测量采用ImageJ软件，数据经正态性和方差齐性检验后，使用t检验或Wilcoxon检验进行统计分析（p<0.05视为显著）。

2.3 Molecular and Phylogenetic Analyses

采用酚-氯仿法从滤纸血样提取DNA，嵌套PCR扩增细胞色素b基因（cytb）478 bp片段（引物：HaemNFI/HaemNR3和HaemF/HaemR2）。PCR产物经6%聚丙烯酰胺凝胶电泳验证，纯化后双向测序。序列使用ChromasPro校对，并通过GenBank和MalAvi数据库进行比对。系统发育分析采用贝叶斯推断（MrBayes 3.6），以TPM2u+F+I+R3等模型分区处理，运行500万代马尔可夫链。遗传距离计算采用Kimura双参数模型（MEGA11）。

3 Results

3.1 Description

血涂片显示白肩喷鴷感染Plasmodium (Novyella) sp.和Trypanoma sp.（未展示数据），疟原虫血症强度为0.12%。所有血期阶段均可见，以滋养体和裂殖体为主。新种命名为：

Plasmodium (Novyella) pyriglenae sp. nov.

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  模式宿主：白肩喷鴷（Pyriglena leucoptera）
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  模式产地：巴西米纳斯吉拉斯州弗洛雷斯塔尔
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  模式标本：hapantotype（编号AM070 A/B）保存于米纳斯吉拉斯联邦大学
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  DNA序列：cytb谱系PYLEU01（GenBank PV821343）
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  分布：谱系PYLEU01曾在米纳斯吉拉斯州和圣保罗州检出，宿主包括P. leucoptera、Dysithamnus mentalis和D. plumbeus

3.1.1 Trophozoites

滋养体多位于红细胞极位或侧位，幼体呈卵形含空泡，成熟体呈阿米巴状，含>0.5 μm棕色色素颗粒。细胞核显著，可见细胞质突起，不接触或位移宿主细胞核。

3.1.2 Erythrocytic Meronts

裂殖体位于成熟红细胞极位或侧位，细胞质稀少，不位移宿主核。77.14%裂殖体含4个裂殖子，7.14%含2-3个，4.29%含5-6个。72.86%裂殖体含单个色素颗粒，11.43%含两个。部分裂殖体呈"领结"形态（Mohammed 1958描述）。

3.1.3 Gametocytes

配子体位于红细胞侧位，位移宿主核。成熟体沿核生长填充细胞极，但不完全环绕。核形态分散难测量，色素颗粒4-12个，分布随机。微配子体与巨配子体形态相似，无明显二态性。

3.1.4 Remarks

新种具诺维虫亚属典型特征（小裂殖体、稀少细胞质、 elongated配子体）。与P. rouxi相似但可通过5-6裂殖子区分；与P. vaughani区别在于常见4裂殖子形态；与P. hexamerium和P. homopolare区别在于较少裂殖子数（后者常≥5）。配子体细胞质苍白、核显著，年轻体接触宿主核膜，成熟体含中等色素颗粒。遗传学显示与P. homopolare相似度95.82%，与其他诺维虫种差异>5%。

3.2 Molecular and Phylogenetic Analysis

cytb序列（478 bp）显示单一感染谱系PYLEU01（与JX021484一致）。贝叶斯系统发育分析表明PYLEU01位于诺维虫亚属分支，与P. homopolare、P. vaughani、P. unalis等形成独立进化支。配对遗传距离显示：与P. homopolare差异4.5%，与P. vaughani差异5.9%，与P. rouxi差异6.6%，支持其为新物种。

4 Discussion

南美洲禽血孢子虫遗传多样性高，但仅少数谱系关联形态种。本研究通过整合分类将谱系PYLEU01关联至新形态种P. (N.) pyriglenae。该谱系目前仅见于巴西蚁鸟科（Thamnophilidae）鸟类，提示可能存在宿主特异性。遗传分化度（>4.5%）支持物种独立性，但需注意形态种间可能存在低遗传分化（如<1%）。新种特征包括：四裂殖子为主裂殖体、侧位滋养体、单色素颗粒与无色/蓝色折射球。系统发育显示PYLEU01与P. homopolare、P. unalis、P. vaughani和P. nucleophilum近缘，但形态特征（裂殖子数、色素分布、配子体位置）显著区分。同宿主其他谱系（PYLEU03/PYLEU06）虽遗传差异<1.5%，但缺乏形态数据，是否同种仍需验证。本研究首次为PYLEU01谱系提供形态学依据，证实cytb基因在血孢子虫多样性研究中的价值，并强调整合分类对揭示寄生虫进化的重要性。

Acknowledgments

感谢所有参与野外采样和实验分析的人员。研究得到FAPEMIG（APQ-01697-24）和CNPq（420169/2023-7, 443909/2024-5）资助。