SPAG6的双面性：在广泛表达的乳腺癌中诱导管腔细胞上皮间质转化（EMT）

本综述揭示了SPAG6（精子相关抗原6）在乳腺癌中的双重角色：其启动子高甲基化导致广泛表达缺失，但在管腔亚型中过表达可诱导上皮间质转化（EMT）、增强迁移能力并影响细胞连接。研究通过TCGA和WSG PlanB队列（n=2241）证实其表达模式，并利用体外模型证明SPAG6通过调节E-cadherin、vimentin和细胞骨架重编程驱动肿瘤进展，为乳腺癌靶向治疗提供新视角。

　　

1 引言

乳腺癌是全球女性中最常诊断的癌症和癌症死亡的主要原因之一，每年约有210万新发病例，占女性所有癌症的四分之一。乳腺癌是一种高度异质性的疾病，具有多样的组织病理学、遗传和表观遗传特征，与不同的临床结局相关。近年研究表明，启动子高甲基化（de novo promoter hypermethylation）是乳腺癌发生和发展中的早期且频繁事件，并参与肿瘤进展。DNA甲基化发生在胞嘧啶的5-碳位置，位于鸟嘌呤的5'端，即CpG二核苷酸（CpG）。CpG在启动子区域聚集成CpG岛，约占人类基因的50%。在乳腺癌中，启动子区域CpG岛的高甲基化经常被观察到，是肿瘤抑制基因（TSG）失活的重要机制。表观遗传失活的TSG被称为2类TSG（class 2 TSG），以区别于具有遗传改变的1类TSG。在乳腺癌中，高甲基化的潜在2类TSG在细胞周期调控、凋亡、DNA修复、组织侵袭和转移、血管生成和激素信号传导等方面发挥重要作用。分析2类TSG的癌症特异性启动子高甲基化及其对乳腺癌发生的贡献，可能为更精确的乳腺癌预后和治疗提供重要线索。

我们先前发现精子相关抗原6（SPAG6）基因在乳腺癌中高甲基化，并将其作为SNiPER panel的一部分，用于基于液体活检的早期乳腺癌检测。SPAG6是莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）瘫痪鞭毛（PF16）的直系同源物，编码一种定位于9+2轴丝中央装置的蛋白，参与纤毛和鞭毛运动。SPAG6包含八个连续的armadillo重复序列，参与蛋白质-蛋白质相互作用。大约一半的SPAG6缺陷小鼠在成年前死于脑积水，存活到成熟的雄性由于鞭毛运动减少而不育。有趣的是，SPAG6敲除小鼠由于中心体极化和肌动蛋白清除的丧失导致免疫突触形成不当，从而损害体液免疫。在过表达SPAG6的COS-1细胞研究中，发现SPAG6定位于微管蛋白阳性的结构。Zhang等人发现SPAG6装饰一部分微管，尤其是核周围的微管。

我们最初的假设是，SPAG6通常作为2类肿瘤抑制基因（C2TSG）发挥作用，由于其频繁的高甲基化在乳腺癌中。类似情况在肺癌（NSCLC）中也有描述，SPAG6表达因启动子高甲基化而频繁丢失。然而，最近来自其他增殖性疾病的数据将致癌作用归因于SPAG6，例如在骨髓增生异常综合征（MDS）和急性髓系白血病（AML）中，其过表达。在AML患者中，SPAG6表达与其他六个基因一起可用于敏感监测微小残留疾病和预后。在MDS细胞系SKM-1和AML细胞系K562中沉默SPAG6导致增殖显著减少和凋亡增加，伴随TP53、PTEN和几个半胱天冬酶表达增加，表明通过PI3K/Akt通路调节凋亡。此外，肝癌患者的肿瘤组织显示SPAG6表达显著高于正常肝组织，且丰富的肿瘤表达与较低的5年生存率相关。因此，SPAG6似乎根据组织类型和给定的细胞分子背景具有不同的功能（即肿瘤抑制或致癌功能）。迄今为止，SPAG6在乳腺癌中的表达和功能尚未研究。我们因此旨在研究其在这种多面性和异质性疾病中的作用。我们的数据明确证明了SPAG6在管腔乳腺癌细胞EMT和迁移中的作用。

2 方法

2.1 细胞系

人乳腺癌细胞系T-47D和MCF-7从美国类型培养物集存库（ATCC）获得，并根据制造商的说明培养（37°C，95%湿度，5% CO₂）。细胞系每月检测支原体，并在工作开始时使用Multiplexion GmbH的多重细胞认证进行认证。所有实验均使用无支原体细胞进行。

2.2 SPAG6-EGFP克隆

SPAG6（转录变体1，NM_012443）的编码序列从SPAG6-pT-Rex-DEST30载体PCR扩增，并克隆到pWPXL-EGFP表达载体中，使用BamHI和MluI生成pWPXL-SPAG6-EGFP。SPAG6-EGFP的正确序列通过DNA测序确认。

2.3 细胞增殖和XTT测定

细胞增殖在接种1×10⁵细胞/孔于6孔板后24、48、72和96小时测定。所有测量均重复三次。在选定时间点，用CASY细胞计数器计数和分析细胞。对于XTT测定，1×10³细胞/孔接种于96孔板。每24小时，使用XTT细胞增殖试剂盒II根据制造商说明测定细胞活力。不含细胞的培养基孔作为阴性对照。测量使用Tecan Infinite 2000 ELISA阅读器进行。

2.4 凋亡测定

对于此测定，2×10⁴细胞/孔接种于96孔板，24小时后，使用Apo-ONE均匀半胱天冬酶-3/7测定试剂盒定量凋亡。用星形孢菌素（1μM）处理的细胞作为阳性对照。荧光测量使用Tecan Infinite 2000 ELISA阅读器进行。

2.5 集落形成测定

1×10³细胞在6孔板中重复接种长达两周。每天检查集落形成以确定终点。之后，细胞用0.5%结晶紫（10%甲醛，80%甲醇和10% H₂O）固定和染色。板然后干燥、成像并手动计数集落。

2.6 统计分析

计算描述性统计以总结数据。使用D'Agostino-Pearson正态性检验检查数值变量的正态分布。使用Mann–Whitney U检验或t检验比较两个独立组。使用单因素ANOVA结合Tukey方法比较三个或更多独立组。计算Spearman相关性以确定SPAG6启动子甲基化与基因表达之间的关联。使用WSG PlanB III期试验数据，评估SPAG6对无病生存（DFS）和总生存（OS）的预后影响。绘制Kaplan–Meier曲线并使用对数秩检验比较SPAG6类别。构建单变量Cox模型，所有人口统计学和基线变量作为单独协变量。此外，构建双变量Cox模型，SPAG6类别和每个其他协变量分别以识别SPAG6效应的混杂因素。将单变量Cox模型中SPAG6效应改变超过10%的变量视为混杂因素。多变量Cox模型包括SPAG6类别、所有混杂因素和所有单变量模型中p<0.1的变量。除非SPAG6效应改变超过10%，否则移除多变量模型中不显著的变量。此外，在最终多变量模型中测试管腔A状态和SPAG6之间的交互作用。使用Schoenfeld残差测试比例风险假设。p值≤0.05被认为显著。使用SPSS 25.0、GraphPad Prism 10.0、R Statistical Software v4.0.3和STATA version 17进行统计分析。

3 结果

3.1 SPAG6在乳腺癌分子亚型中的表达和启动子甲基化

我们先前在乳腺癌患者血浆中检测到SPAG6高甲基化，表明这种进化高度保守但特征不清的基因可能在乳腺癌生物学中发挥作用。因此，我们进一步研究TCGA乳腺癌队列中不同类型乳腺癌组织中SPAG6的表达水平和甲基化状态。该乳腺癌队列的临床特征概述总结在表S1中。与我们之前的发现一致，正常乳腺组织仅显示低SPAG6启动子甲基化（β值≥0.2：10.3%），在原发乳腺癌中显著增加至95.7%（p<0.001，图1A）。相反，乳腺癌中SPAG6表达显著低于正常乳腺组织（p<0.001，图1B）。此外，SPAG6 mRNA表达和DNA甲基化呈负相关且强相关（Spearman r：-0.41，p<0.0001）。SPAG6高甲基化存在于所有分子亚型（按PAM50分类）除正常样组外（图1C）。管腔A肿瘤显示最低平均甲基化水平（平均β值：0.46），与管腔B（平均β值：0.54）、HER2富集（平均β值：0.52）和基底样肿瘤（平均β值：0.55）相比。有趣的是，在观察mRNA表达时，一组管腔A肿瘤（平均表达：3.52；75%百分位数：6.30—最大值：12.10）以及一小群管腔B肿瘤过表达SPAG6，与健康乳腺组织（平均表达：3.64；75%百分位数：5.23—最大值：6.68）以及基底样癌症（平均表达：2.45；75%百分位数：2.45—最大值：10.26）相比（图1D）。

3.2 全面蛋白表达分析证实乳腺癌中SPAG6普遍下调，同时在一小部分管腔肿瘤中强烈上调

SPAG6染色数据可用于WSG PlanB III期试验中3198名患者中的2241名。这些可用患者数据的临床病理参数概述显示在表S2中。虽然SPAG6在正常乳腺组织中丰富表达（图1E），但在三阴性乳腺癌（TNBC）中表达几乎完全丢失（图1F），证实我们先前的结论，即由于启动子高甲基化导致的SPAG6表达丢失可能是检测TNBC的合适生物标志物。有趣的是，在管腔乳腺癌中发现差异表达模式（图1G,H），在TNBC中未观察到（图1I）。管腔肿瘤在大多数情况下显示SPAG6表达丢失，但一小群，约10%的病例，显示高SPAG6表达（图1H为管腔A肿瘤），从而与mRNA水平发现的表达模式密切相似（图1D）。作为对照，睾丸组织作为阳性对照显示精子细胞中高内源性SPAG6蛋白表达（图1J），但在省略SPAG6抗体的样本中不显示（图1K）。此外，结肠粘膜组织作为阴性对照显示上皮细胞中缺乏内源性SPAG6表达（图1L）。

接下来，分析SPAG6表达丢失对生存的影响。虽然典型预后标志物如淋巴结状态、Ki67状态和组织学分级显示对OS和DFS的显著影响，但SPAG6表达的影响不显著（表S3和S4；图S1）。WSG PlanB研究中的实验治疗未显著改变SPAG6与结局的估计关联。这些数据表明，SPAG6表达丢失与乳腺癌不良预后无关，与我们基于该肿瘤实体中大量SPAG6启动子高甲基化的原始假设相反。然而，我们在数据集中观察到一个有趣趋势，表明SPAG6可能在管腔A肿瘤中作为癌基因发挥作用。在WSG PlanB队列中，与SPAG6阴性肿瘤相比，SPAG6阳性肿瘤在管腔A肿瘤中显示肿瘤复发风险增加（DFS）（HR 1.64，95% CI 0.88–3.06），而在管腔A阴性肿瘤中风险降低（0.86，95% CI 0.58–1.28）（表S5和S6）。尽管此效应尚未达到统计学显著性（p=0.085 for interaction），但也可在TCGA队列中注意到（图S2），尽管仅在TP53突变管腔肿瘤中（图S2B,D），而非TP53野生型管腔肿瘤中（图S2A,C）。不幸的是，对于WSG-PlanB队列，无法进行相应的TP53分析，因为该队列的TP53状态不可用。

3.3 SPAG6过表达显著影响管腔型乳腺癌细胞的集落形成能力

面对TCGA乳腺癌数据集中SPAG6 mRNA表达模式和在大型TMA乳腺癌队列中蛋白水平的有趣观察，我们旨在解密SPAG6在乳腺癌功能获得细胞培养模型中的作用，代表管腔（T-47D和MCF-7）乳腺癌细胞系。为此，这两种细胞系使用SPAG6-pWPXL载体编码SPAG6-GFP融合蛋白，通过慢病毒基于基因转移系统转导。所有转染细胞系中SPAG6 mRNA和蛋白均稳健表达（图2F）。

首先，在14天内测量集落形成能力。对照T-47D细胞形成小而密且易于区分的集落，而过表达SPAG6的细胞形成大得多的集落，无需显微镜即可见（图2A，上面板）。结晶紫染色集落的平均灰度值量化证实了此观察（p=0.0004，图2B）。然而，在MCF-7乳腺癌细胞中调节SPAG6表达不影响集落形成（图2A，下面板和2B，p=0.7304）。SPAG6过表达还促进T-47D乳腺癌细胞增殖，但不在MCF-7细胞中，如细胞增殖测定和XTT测定所示（图2C,D）。SPAG6过表达不影响T-47D和MCF-7细胞的凋亡（图2E）。

3.4 SPAG6显著促进管腔型T-47D和MCF-7乳腺癌细胞的迁移

进行经典伤口愈合测定以确定SPAG6过表达对管腔型乳腺癌细胞系迁移的影响。在T-47D细胞中过表达SPAG6稳健增加其迁移能力，证据是伤口闭合比野生型细胞快得多（图3A,B）。在过表达SPAG6的MCF-7细胞中，视觉检查显示与野生型细胞相比无总体差异（图3A）。因此，沿每个伤口边缘六个位置量化平均细胞速度。T-47D细胞以中位速度3.9μm/h迁移，而过表达SPAG6的细胞以15.6μm/h移动，即快4倍（p<0.0001，图3B）。定量测量进一步显示过表达SPAG6的MCF-7细胞也显著快于其对照对应物（野生型细胞中位速度：2.0μm/h，SPAG6过表达细胞中位速度：2.4μm/h，p<0.0001，图3C，见视频S1和S2）。在T-47D和MCF-7中，空载体的表达不影响细胞迁移（图3B,C）。总体，这些数据证明SPAG6过表达可显著诱导管腔型乳腺癌细胞的细胞迁移能力。

3.5 SPAG6过表达诱导EMT并导致T-47D乳腺癌细胞细胞连接分子组成变化

在T-47D细胞中过表达SPAG6也诱导显著形态变化。例如，过表达SPAG6的T-47D细胞更容易从细胞培养容器表面脱离并形成在野生型细胞中不存在的片状伪足突起（图4A）。我们因此假设SPAG6可能影响这些细胞中的EMT。在过表达SPAG6的T-47D细胞中，E-cadherin和vimentin这两个主要EMT标志物的表达分别减少和增加（图4B）。与过表达SPAG6的MCF-7细胞中缺乏总体形态EMT变化一致，E-cadherin和vimentin的表达未受SPAG6总体影响（图4B）。在T-47D细胞中，SPAG6过表达促进形成更不紧凑的细胞单层。为测试SPAG6是否影响细胞连接形成的假设，我们将T-47D和MCF-7细胞以高细胞密度接种，并在24小时后用抗β-catenin和E-cadherin的抗体染色，这两种细胞连接的特异性标志物。如预期在野生型对照细胞和仅表达空载体的细胞中，E-cadherin强烈定位在细胞连接处，与肌动蛋白一起发现（图5A）。值得注意的是，在过表达SPAG6的T-47D细胞中，肌动蛋白和E-cadherin几乎不在细胞连接处发现（图5A）。在过表达SPAG6的MCF-7细胞中，未观察到肌动蛋白和E-cadherin定位的变化（图5B）。

由于vinculin直接与肌动蛋白相互作用并定位在细胞连接处，我们检查SPAG6表达细胞中肌动蛋白在细胞连接处的减少是否也影响vinculin在这些位点的定位。与上述观察一致，在T47D中表达SPAG6，但不在MCF-7细胞中，导致vinculin位移和肌动蛋白在细胞连接处的减少（图6）。因为E-cadherin通常与β-catenin在细胞连接处关联，我们还用抗β-catenin和E-cadherin的抗体标记T-47D和MCF-7细胞。有趣的是，发现β-catenin定位在细胞连接处，与SPAG6表达无关（图7A,B）。这些观察表明SPAG6影响细胞连接的形成和分子组成，与T-47D乳腺癌细胞中的EMT表型相关。

3.6 SPAG6过表达效应在携带TP53突变的基底型乳腺癌细胞系中

由于SPAG6可能在管腔乳腺癌细胞中具有肿瘤促进特性且这种致癌效应可能依赖于失活的TP53基因的意外和有趣发现，我们扩展研究以包括两个基底乳腺癌细胞系的分析，其中TP53基因突变（图S3）。在MDA-MB-231和BT-549乳腺癌细胞系中，SPAG6过表达导致集落形成抑制，而对增殖无显著影响。由于两种细胞系携带TP53错义突变，我们得出结论，SPAG6的不同生物学行为主要取决于分子亚型（管腔与基底），仅次要取决于TP53状态。

4 讨论

理解可能参与癌症发展或进展的新候选基因的功能对于探索改善癌症诊断和治疗的新方法至关重要，特别是对于个性化治疗。SPAG6就是这样一个候选基因，其在运动单细胞生物中的功能相当清楚，但在高等生物中的功能仍 largely 不清楚，尚未直接与癌症相关过程关联。我们最近将SPAG6基因识别为一种新的潜在2类肿瘤抑制基因（C2TSG），可能适用于基于血液的乳腺癌筛查，由于其频繁的启动子DNA高甲基化，特别是在基底型癌症中。这项研究首次显示SPAG6对管腔乳腺癌细胞的迁移和集落形成能力有深远影响，尽管未来研究应扩大检查的管腔细胞系数量。此外，SPAG6在T-47D细胞中诱导EMT，并影响该细胞系中细胞连接的形成和分子组成。

在所有乳腺癌分子亚型中，除定义不清的“正常样”组外，SPAG6启动子显示DNA甲基化水平显著增加，伴随其表达显著减少。然而，仔细查看不同分子乳腺癌亚型管腔A和管腔B显示甲基化频率和SPAG6 mRNA表达均有相对大的分散。这在管腔A乳腺癌中最明显，其特征为两种不同的SPAG6表达模式，即一大群低表达和一小群高表达（见图1D中75th百分位数），后者比正常乳腺组织具有更高的SPAG6 mRNA表达。考虑到对于基底样乳腺癌，已经显示该分子亚型可划分为几个分子“亚亚型”，未来希望能够将管腔A和管腔B乳腺癌亚型进一步划分为更多分子亚型，为此必须识别合适的生物标志物。我们尚不能声称已将SPAG6识别为这样一种生物标志物，但肿瘤促进效应在管腔肿瘤中可能依赖于TP53突变状态的观察 potentially 有趣，应跟进。到目前为止，我们仅分析了两种管腔乳腺癌细胞系，且一种是TP53突变（T-47D）显示SPAG6过表达后肿瘤促进效应显著更强，如EMT诱导，比TP53野生型细胞系MCF-7。由于突变TP53因其增强癌症细胞运动和转移的作用而被认可，SPAG6可能与突变TP53协同，导致T-47D细胞运动稳健增加。相反，SPAG6对MCF-7细胞运动的影响（即增加）可能被野生型TP53减轻，已知其减少细胞运动的能力。目前，我们关于具有TP53突变和高SPAG6表达的管腔乳腺肿瘤可能代表更侵袭性亚型的假设只能视为未来SPAG6表达研究的一个值得注意的点，因为TP53状态对PlanB队列不可用，且PlanB乳腺癌队列中潜在的SPAG6诱导致癌表型（HR 1.64，p=0.085）未达到统计学显著性。这可能由于亚组动力不足，因为SPAG6“高表达者”在管腔A和管腔B肿瘤中的比例仅占这些亚组所有肿瘤的5%–10%。在如此小的组中，统计上难以验证其他共因素的影响。最后，高SPAG6表达肿瘤数量少也可能导致生存数据分析显著性不足。最终，此问题只能通过分析极大乳腺癌队列解决，相关组织病理学信息（分子亚组分类标志物、TP53突变状态、SPAG6表达状态）可用。

SPAG6基因在不同癌症实体或不同分子背景（由肿瘤形态亚组定义）中可能扮演不同角色（即潜在肿瘤抑制子与潜在癌基因）的假设得到以下数据支持。SPAG6启动子高甲基化且其表达在肺癌（NSCLC）中减少，表明在该肿瘤实体中肿瘤抑制功能。SPAG6启动子高甲基化也在非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）中发现，尽管甲基化似乎不与特定肿瘤特征相关。相反，更高表达水平的SPAG6已在血液恶性肿瘤包括淋巴瘤和骨髓增生性肿瘤（MPN）中证明。高SPAG6表达的AML患者生存差。对AML及其前体骨髓增生异常综合征（MDS）的进一步研究表明SPAG6通过PTEN/PI3K/AKT和TRAIL通路调节凋亡，并通过AKT/FOXO通路在两种疾病中调节增殖。在MPN中，SPAG6的肿瘤促进功能与MPN细胞对干扰素-α治疗反应减少相关。最近研究还表明SPAG6增强AML和B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）细胞增殖，以及促进皮下肿瘤生长。这表明SPAG6可能是AML、B-ALL和MDS中潜在治疗性癌基因样靶点。肝癌组织也显示比健康组织更高的SPAG6表达，且丰富SPAG6表达患者显示显著较低的5年生存。此外，在肝癌细胞系HCCLM3中敲低SPAG6导致增殖和迁移受损，表明SPAG6可能 contribute 肝癌发展和进展。SPAG6作为肿瘤促进子和肿瘤抑制子的矛盾双重角色取决于组织背景，目前尚无法解释。然而，这不是新观察，因为研究更深入的调节剂（比SPAG6），如Notch受体和YAP（Hippo信号通路的终端介质），已显示具有双重角色作为生长促进子和抑制子，取决于分子或细胞背景。也有一些著名肿瘤抑制基因可承担致癌功能的例子，因此癌症相关基因的这种“双重代理游戏”仍然是一个令人兴奋的研究领域，对临床评估遗传和表观遗传改变也很重要。关于SPAG6蛋白已知的是，它是一种支架蛋白，可根据细胞背景参与不同信号网络。该蛋白的八个armadillo重复创建多个结合位点用于多样蛋白伙伴。因此，SPAG6可能作为分子开关，根据给定细胞背景中可用结合伙伴和主导信号通路促进或抑制癌症进展。有趣的是，在一些肿瘤实体，如头颈鳞状细胞癌和肺鳞状细胞癌中，SPAG6表达与趋化因子和主要组织相容性复合物分子表达相关，表明免疫细胞衍生信号可能上调SPAG6转录。

细胞运动和细胞骨架功能失调是癌症细胞中的特征现象，有助于其传播到次要部位。在肿瘤发生过程中，癌症细胞经历分子和细胞变化，包括细胞-细胞粘附、细胞-基质粘附重塑，以及信号通路失调导致肌动蛋白细胞骨架重塑。在此背景下，我们证明SPAG6对T-47D和MCF-7均有稳健效应并显著增加其运动。我们的观察与先前研究一致，显示在肝癌细胞系HCCLM3中沉默SPAG6损害细胞迁移。再次，检查SPAG6功能时必须考虑细胞背景和肿瘤类型，因为过表达SPAG6也可能具有抑制效应，如在神经细胞中显示损害细胞迁移。细胞迁移是一个循环过程，由Rho家族GTPases、PI3Ks、整合素、微管和囊泡运输信号建立和维护。虽然理解SPAG6在细胞迁移中功能的分子机制超出本研究范围，但合理假设SPAG6可能直接或间接参与上述一个或多个过程。例如，SPAG6可能通过其八个连续Armadillo重复影响微丝、微管和中间丝功能，如先前显示用于其他具有Armadillo重复的蛋白，包括β-catenin。除了与微管相互作用，β-catenin是Wnt信号中的关键节点和连接细胞通过cadherin蛋白的含肌动蛋白连接的组件。最后，有趣的是注意到SPAG6与myosin 1D相互作用，一种I类分子马达，促进结直肠和乳腺癌发生并刺激EGF受体家族信号。由于myosin 1D和EGFR已知促进细胞迁移，合理的是SPAG6通过结合myosin 1D调节细胞迁移。

EMT是一个生物学过程，期间肿瘤组织内细胞经历若干变化，使其获得间充质细胞表型，伴随运动能力、侵袭性和凋亡抗性变化。在我们的研究中，我们证明SPAG6过表达在T-47D细胞中诱导若干EMT特征。SPAG6对细胞-细胞粘附有主要影响，特征为E-cadherin下调和这些位点肌动蛋白、vinculin和β-catenin定位减少。此外，E-cadherin和vimentin在T-47D细胞中被SPAG6上调。应注意过表达SPAG6的MCF-7细胞未显示如此 distinct EMT表型。这可能由于MCF7细胞中野生型TP53状态，因为SPAG6可能与不同组蛋白相互作用，取决于TP53是否突变。然而，我们不能排除其他差异（除了TP53突变） between the two cell lines contributed to their behaviours。在此背景下，必须强调SPAG6过表达在T-47D细胞中更显著，而MCF-7细胞显示升高内源性SPAG6水平。因此，MCF-7细胞中现有内源性SPAG6可能使它们对SPAG6-GFP表达“难治”，导致行为改变更 subdued。由于癌症细胞通常表现EMT不同“阶段”，最初保留一些上皮特征同时获得间充质 traits，SPAG6对T-47D和MCF-7细胞的不同效应可能反映T-47D细胞中更完整阶段和MCF-7细胞中部分EMT阶段。

SPAG6蛋白可能在未来作为背景依赖性治疗靶分子出现。在癌症如多发性骨髓瘤、急性髓系白血病和Burkitt淋巴瘤中，SPAG6通过重要信号通路如MAPK/ERK和PTEN/PI3K/AKT促进增殖、抑制凋亡和增强肿瘤