综述：正黄病毒治疗设计与疫苗开发的甜蜜之处

本综述系统探讨了以正黄病毒（Orthoflavivirus）糖蛋白（如E、prM和NS1）的糖基化（N-linked glycosylation）为靶点的新型抗病毒策略和疫苗设计，涵盖糖模拟抑制剂（如GAGs、SCR）、糖基化修饰抗体（如避免ADE效应）及糖基化过程调控（如α-葡萄糖苷酶抑制剂）等多重方向，为开发广谱抗病毒疗法提供了关键见解。

　　

1 引言

正黄病毒属（Orthoflavivirus）的登革病毒（DENV）、寨卡病毒（ZIKV）、日本脑炎病毒（JEV）、西尼罗病毒（WNV）和黄热病毒（YFV）是最重要的蚊媒人类病原体。这些病毒共有的关键特征是E、prM和NS1蛋白的N-连接糖基化，这一翻译后修饰（PTM）由宿主细胞机制调控，在感染过程中调控病毒与宿主分子的相互作用，成为开发特异性治疗和疫苗的有前途的靶点。

1.1 病毒糖蛋白

E蛋白大小约53–60 kDa，以90个反平行同源二聚体排列在病毒包膜上。其单体分为EDI、EDII和EDIII三个结构域。所有正黄病毒E蛋白在Asn153/154位点具有保守的N-糖基化位点，而DENV在Asn67还有额外位点。E蛋白参与细胞受体识别、结合和膜融合，并激发大部分中和抗体，是疫苗设计的主要靶标。

prM蛋白约19–21 kDa，经宿主弗林蛋白酶切割后产生M蛋白（约10 kDa）。其在Asn69位点糖基化，糖基化对其正确发挥E蛋白折叠的分子伴侣活性至关重要。prM和E蛋白的糖基化使病毒对低pH灭活更具抗性，并导致prM/E颗粒更有效分泌。

非结构蛋白1（NS1）是352个氨基酸的糖蛋白，分子量46–54 kDa。大多数正黄病毒NS1在Asn130和Asn207/208有两个N-糖基化位点，WNV在Asn175还有一个预测位点。NS1是复制复合体的组成部分，但也分泌出来并通过多种机制与致病性相关。其N-糖基化选择性参与折叠和分泌等过程。NS1的N-糖基化基序在四级结构中位于不同位点：隐藏的Asn207基序上是甘露糖丰富的聚糖，而暴露的Asn137基序上是复合聚糖，这种模式调控了NS1与宿主细胞中某些凝集素相互作用的能力。

1.2 病毒蛋白的糖基化过程

E、prM或NS1的N-糖基化在内质网（ER）中开始，通过寡糖转移酶（OST）复合物将连接在长醇载体上的脂质连接的高甘露糖寡糖核心（Glc₃Man₉GlcNAc₂）添加到蛋白质特定的天冬酰胺残基（NxS/T）上。当目标蛋白向高尔基体转运时，Glc₃Man₉GlcNAc₂被不同酶编辑，如ER中的糖苷酶I/II修剪连接到新生糖蛋白上的N-连接聚糖的三个末端葡萄糖部分，以及糖基转移酶编辑该分子，产生混合复合型N-聚糖。由于N-糖基化过程完全由细胞机制执行，蛋白质最终的N-聚糖反映了受感染细胞的糖生物学特征。

1.3 基于病毒蛋白聚糖和受体相互作用的治疗策略

基于正黄病毒或其受体糖生物学的治疗方法响应了对具有广谱作用抗病毒药物的需求。目前主要开发两个方面：中断病毒对靶细胞的识别或修饰糖基化过程。

1.3.1 避免病毒-细胞结合

最广泛开发的中断病毒靶细胞识别的方法是设计模拟E或NS1聚糖被细胞受体识别的分子。硫酸化糖胺聚糖（GAGs）是带负电荷的多糖分子，是正黄病毒的通用宿主附着因子，已被研究作为抑制感染的泛靶点。GAG类似物（如PG545）在登革热小鼠模型中显示出可减少病毒血症和循环NS1水平。小分子合成碳水化合物受体（SCR）通过非共价相互作用结合碳水化合物，通过竞争性结合正黄病毒E蛋白聚糖，抑制E蛋白与靶细胞膜上凝集素受体的相互作用，从而在体外预防病毒感染。

位于质膜外表面的硫酸肝素（HS）分子已被描述为几种正黄病毒的病毒受体。HS-病毒结合是HS分子负电荷与病毒表面糖蛋白E碱性残基之间的静电相互作用。考虑到HS对E蛋白的广泛识别，几种模拟HS作用的分子已被开发出来。具有高度磺化化学修饰的环糊精（CD）可以模拟HS，并在体外证明对DENV具有广谱抗病毒作用。几种HS模拟化合物，如硫酸化多糖、苏拉明、戊聚糖多硫酸酯（PPS）和PI-88，已在不同细胞系和几种正黄病毒（包括DENV、JEV、WNV和YFV）中显示出广谱抗病毒作用，并已被批准进行临床试验。此外，虾来源的HS或硫酸化大肠杆菌K5衍生物（K5-OS(H)和K5-N,OS(H)）也有效竞争细胞受体，阻断病毒粒子-细胞相互作用。这些研究识别出E蛋白受体结合域III上的306-314氨基酸区域是所有四种DENV血清型（也可能是所有正黄病毒）的结合位点区域，突出了该氨基酸区域作为泛正黄病毒治疗设计靶点的潜力。

树突状细胞特异性细胞间粘附分子-3-抓取非整合素（DC-SIGN）是一种C型凝集素，是DENV和其他正黄病毒的主要附着受体之一。DC-SIGN分子识别E蛋白表面的聚糖，但这种识别促进了病毒传播。由于这种相互作用的重要性，几种分子已被测试用于竞争与E蛋白上结合DC-SIGN的聚糖。碳水化合物结合剂（CBAs）结合病毒表面的特定碳水化合物分子，阻断其进入和融合到靶细胞。一些源自植物的凝集素，如 Hippeastrum hybrid (HHA)、Galanthus nivalis (GNA) 和 Urtica dioica (UDA)，已在单核细胞衍生的树突状细胞（MDDC）中对所有四种DENV血清型表现出高抗病毒活性。尽管植物凝集素作为抗正黄病毒感染的治疗剂潜力巨大，但该领域近期没有进展。最近，用高甘露糖苷酶装饰的超支化径向对称纳米分子（称为树枝状聚合物）在低浓度下有效阻断DENV在细胞培养中的摄取，糖模拟DC-SIGN配体。尽管树枝状聚合物作为治疗剂潜力很大，但其亲和力需要优化以提高与DC-SIGN结合的螯合效应。其他分子，如多价糖缀合物十三富勒烯、天然多糖半乳甘露聚糖和牛乳铁蛋白，也已在体外和体内证明可高效阻断DC-SIGN和其他正黄病毒受体，如低密度脂蛋白受体（LDLR）。不幸的是，这些方法均尚未可用于人类。

最近，SRB-1被描述为NS1蛋白的细胞受体。NS1聚糖在清道夫受体B类1型（SRB1）结合中的参与以及这种相互作用在登革热发病机制中的潜在后果尚不清楚。尽管如此，NS1与该受体及其他可能受体的相互作用看起来是未来评估的一个有趣靶点。

1.3.2 抗体糖基化的修饰

抗体Fc区上的N-糖基化是调节其免疫原性和功能的关键，可作为调节因子定义其在保护或病理中的作用。尽管文献中直接将通过抗体糖基化调节免疫力作为正黄病毒疾病治疗机会的例子很少，但该领域的一些发现值得一提。

抗体依赖性增强（ADE）是一种现象，其中来自初次感染的亚中和量的病毒特异性抗体增强病毒进入带有FcR的靶细胞。ADE已在黄病毒科成员（如DENV、ZIKV和WNV）中得到充分描述。因此，在设计涉及抗体的治疗和疫苗时需要考虑ADE。一些避免ADE的策略包括废除或修改中和抗体的N-糖基化模式。人单克隆抗体（HuMab）B3B9作为一种生物治疗工具被开发出来，成功证明了对四种DENV血清型的交叉中和活性。然而，在亚中和浓度下，它在携带Fc-γ受体（FcR）的细胞上产生感染增强，限制了其作为治疗工具的应用。对该HuMab的N-糖基化位点进行的修饰负面影响其与FcR的结合亲和力，废除了其ADE活性。这一发现强化了抗体聚糖在驱动DENV感染中的重要性，因此在设计此类生物治疗剂时需加以考虑。

此外，据报道，不仅DENV感染引发的抗体中N-聚糖的存在可以调节免疫反应，聚糖的类型也可以。在这方面，DENV特异性去岩藻糖基化IgG1抗体水平显著升高与更严重的DENV疾病相关。考虑到聚糖类型的重要性，几种方法考虑了改变用于生产重组抗体的表达系统。例如，在 Nicotiana benthamiana ?XF 植物系统（一种缺乏植物特异性N-聚糖残基的糖基化突变体）中生产的针对WNV和DENV E蛋白的特异性抗体，已在鼠模型中证明具有体外中和和体内保护作用，且未发生ADE，表明具有不同N-糖基化模式的植物生产抗体在基于抗体的治疗中可能是安全且高效的。

1.3.3 N-糖基化与抗体反应

从感染患者中分离的中和抗体也被用作E蛋白的有效阻断剂，在WNV小鼠模型中降低了致死率。然而，在抗体识别位点添加N-聚糖部分可在体外作为中和逃逸机制发生，降低抗体中和能力。另一方面，DENV和ZIKV E蛋白上的聚糖也有助于引发中和抗体，这是在设计基于抗体的疗法时需要考虑的重要方面。

DENV E二聚体界面暴露了一个在所有四种DENV血清型中保守的表位，称为E蛋白二聚体表位（EDE），其中包括暴露的E融合环主链和两个保守的聚糖链。EDE抗体可以中和所有四种DENV血清型以及ZIKV，引起了疫苗开发的极大兴趣。最初在患者分离的DENV和ZIKV中鉴定出这个保守表位，并证明当EDE表位被糖基化时（EDE2），它参与细胞结合，但未糖基化时（EDE1）则不参与。然而，EDE1抗体比EDE2抗体能更好地中和ZIKV。这些EDE抗体的特征是一个极好的例子，说明了聚糖在E功能上的重要性；同时，它们也说明了一种克服或避免DENV和ZIKV病毒之间产生的交叉反应免疫的方法，根据疫苗方法的不同，这可能是可取的。

1.3.4 细胞糖基化过程的修饰

在蛋白质从ER到反式高尔基网络的运输过程中，有几个靶点可考虑用于抑制糖基化过程并改变病毒蛋白获得的糖模式。一种常见的方法是通过亚氨基糖（如Celgosivir和N-丁基-脱氧野尻霉素（NB-DNJ））抑制ER驻留的α-葡萄糖苷酶，防止这些酶去除N-连接聚糖上的末端葡萄糖残基。对于DENV，Celgosivir阻止病毒粒子的释放，而用NB-DNJ处理会导致产生未折叠的无功能病毒糖蛋白。亚氨基糖已在临床试验中作为治疗DENV感染的药物进行评估；然而，由于其抗病毒作用在引起副作用的浓度下才能达到，因此尚未被临床批准作为抗病毒药物。最近，证明单剂量的α-葡萄糖苷酶I抑制剂N-(9′-甲氧基壬基)?1-脱氧野尻霉素（MON-DNJ）足以抑制小鼠的DENV感染，使该化合物成为一种有前景的速效药物。

抑制糖基化过程中涉及的其他酶，如内切-α?1,2-甘露糖苷酶（MANEA），也已被测试作为抗病毒靶点。MANEA是一种位于高尔基体内的水解酶，参与N-聚糖修剪，提供了一条独立于经典α-葡萄糖苷酶I/II依赖性途径的糖蛋白成熟途径。MANEA的抑制剂，如GlcDMJ（一种潜在的广谱抗病毒药物），也显示出对DENV的高抗病毒活性。了解这些抗病毒药物的效果将揭示聚糖在病毒蛋白折叠、释放和功能过程中的重要性。

尽管有几种潜在的候选药物，但目前仍没有针对正黄病毒的特许授权治疗。针对糖基化过程元素的化合物是广谱抗病毒药物，有潜力用作立即干预措施，在确认具体诊断之前治疗具有常见症状的正黄病毒感染。在其他情况下，有必要开发基于区分病毒和细胞分子的化合物的治疗方法。此外，结合治疗策略以攻击多个靶点并增强其抗病毒效果可能更有效。

1.4 考虑病毒蛋白聚糖的疫苗策略

免疫原性E、prM和NS1蛋白的N-糖基化是开发抗正黄病毒新型疫苗所利用的主要PTM。在这方面，通过突变氨基酸残基在病毒蛋白中添加或废除N-糖基化位点，以灭活病毒或暴露隐藏表位，并将免疫反应重新导向这些位点。

1.4.1 去除聚糖以灭活病毒

通常，黄病毒抗原蛋白上聚糖的存在与毒力增强有关。例如，在WNV的E蛋白上添加一个N-糖基化位点导致小鼠神经侵袭性、禽类毒力和载体能力增强。最近暴发的ZIKV毒株E蛋白在Asn154位点存在聚糖，与历史非洲株MR766（缺乏该E糖基化位点）相比，与小鼠中毒力更高相关。这种遗传性N-糖基化位点的引入可能导致凝集素受体亲和力增加，从而增加毒力。此外，用缺乏E聚糖的ZIKV免疫的小鼠产生了强大的中和抗体反应，并在野生型ZIKV攻击中得到完全保护。基于这些事实，几项研究为开发基于废除N-糖基化位点的减毒活ZIKV疫苗铺平了道路。在这方面，生成了一个ZIKV疫苗克隆（BeH819015），由MR766株的骨架和近期流行ZIKV株的结构蛋白组成，在E蛋白上有三个氨基酸突变以产生非糖基化重组病毒。从免疫小鼠产生的抗体中和了MR766株，但弱中和了近期ZIKV株，表明突变的残基影响了ZIKV上中和抗体表位的可及性。

NS1的N-糖基化位点突变也降低了感染性病毒的产量，为开发灭活病毒疫苗提供了另一种选择。利用这些事实，证明用编码非糖基化E和NS1的减毒ZIKV疫苗接种的小鼠模型在致死性ZIKV攻击中完全保护。第一个在怀孕小鼠中测试的缺乏NS1 N-连接聚糖的减毒ZIKV疫苗方法对母亲和后代的致死性攻击均提供了保护。因此，该疫苗候选物可能成为在孕妇中测试的一种替代方案。此外，DENV2的NS1蛋白的G53D突变促进了该蛋白的不正确糖基化，引起ER应激，从而激活I型IFN表达。这种机制过程导致DENV2株减毒，抑制病毒感染在昆虫和哺乳动物细胞中的传播。与E和NS1蛋白不同，JEV prM的N-糖基化位点突变在表达prM-E蛋白的亚单位疫苗攻击的鼠模型中并未显著干扰免疫反应。

尽管基于N-连接糖基化的突变病毒疫苗方法具有优势，但一个缺点是用这些减毒病毒通常获得的滴度较低，使得扩增病毒储备变得困难。此外，需要持续检查逃逸突变体的产生和N-糖基化位点的重建。

1.4.2 向病毒蛋白添加聚糖

病毒蛋白的糖基化被认为可以掩盖相关的关键病毒表位，避免被免疫系统识别。由于人工掩盖，表位识别被重新导向更强的免疫学目标，从而能够产生有效的、高度治疗性的中和抗体，或引发高度特异性的抗体，同时避免交叉中和。对于正黄病毒，聚糖掩蔽技术主要用于亚单位疫苗候选物。举例说明这些要点，在ZIKV重组E蛋白结构域III（EDIII）上识别出的不利表位附近引入N-糖基化位点以促进聚糖掩蔽，显著改善了ZIKV亚单位疫苗中和抗体的产生。在另一种旨在避免产生DENV和ZIKV之间引起ADE的交叉反应抗体的方法中，在ZIKV和DENV E蛋白 ij 环（E-248NHT）上引入了聚糖掩蔽突变，结果对ZIKV成功，但对DENV无效。这些矛盾的结果可能是由于这些病毒固有的特性，需要进行额外的研究来阐明这些观察结果。小鼠来源的3H5抗体结合EDIII并强烈中和DENV2，但引起最小的ADE效应。通过在该表位周围添加N-糖基化位点来屏蔽其他表位，允许产生一种突变抗原，用于筛选登革热免疫scFv-噬菌体文库，以选择结合3H5表位的scFv抗体，保持高中和能力而无ADE效应，突出了其作为登革热免疫原的潜力。聚糖掩蔽作为一种策略，使免疫系统专注于识别某些表位以产生所需的、强大的血清型特异性免疫反应，可能成为克服正黄病毒重组疫苗方法一些不利影响的有效解决方案。

2 结论

E蛋白上的N-连接聚糖定义了细胞识别受体，影响宿主许可性和器官趋向性，从而决定了每种病毒引起的临床表现。此外，N-连接聚糖在调节免疫反应中扮演双重角色，要么增强要么减弱中和抗体的产生或交叉反应抗体的发展，从而促进ADE。对于其他病毒如单纯疱疹病毒（HSV）和丙型肝炎病毒（HCV），感染期间对宿主碳水化合物活性酶的需求增加已被报道，并已成为抗病毒治疗的主要靶点。然而，这一策略尚未在虫媒黄病毒中进行探索。鉴于在流行地区需要有效的治疗或疫苗来治疗或预防正黄病毒感染，了解N-糖基化在病毒感染过程中的作用等基本方面将有助于制定有效且广泛的策略来对抗这些全球性感染。