单细胞与代谢组学整合揭示TGFβ信号通路调控结直肠癌肝转移中氧化磷酸化代谢重编程的关键作用

本研究针对结直肠癌肝转移(CRLM)代谢机制不清的难题，通过构建阶梯式小鼠模型，整合代谢组学、单细胞RNA测序(scRNA-seq)和空间转录组学(ST)技术，发现肝转移灶中三羧酸(TCA)循环活性增强并伴随氧化磷酸化(OXPHOS)显著上调。研究进一步鉴定出高OXPHOS恶性上皮细胞亚型，并揭示TGFβ信号通路通过诱导OXPHOS促进转移进程。体内外实验证实抑制TGFβ可降低OXPHOS活性并抑制肝转移，为晚期结直肠癌提供了靶向线粒体代谢的新治疗策略。

　　

在全球范围内，结直肠癌(Colorectal Cancer, CRC)是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率分别位居全球第三和第二位。更令人担忧的是，肝脏作为结直肠癌血行转移的主要靶器官，肝转移已成为结直肠癌患者死亡的首要原因。据统计，在初诊的结直肠癌患者中，约有60%已处于晚期，其中22%已发生远处转移。未经治疗的结直肠癌肝转移患者中位生存期仅为6-9个月，即使经过肝切除联合化疗等综合治疗，中位生存期可延长至40个月以上，但多数患者术后仍会面临复发转移的困境。因此，深入探究结直肠癌肝转移的分子机制，寻找有效的治疗靶点，成为改善患者预后的关键科学问题。

代谢重编程(Metabolic Reprogramming)作为癌症的十大特征之一，在肿瘤发生发展中扮演着关键角色。近年来，越来越多的证据表明，代谢重编程在肿瘤转移过程中发挥着至关重要的作用。肿瘤组织通过重塑代谢途径，以满足其快速生长对生物能量、生物合成和氧化还原平衡的需求。作为细胞代谢的中心细胞器，线粒体在肿瘤代谢重编程中发挥着不可或缺的作用。然而，在结直肠癌肝转移这一特定生物学过程中，肿瘤细胞究竟发生了怎样的代谢适应？其背后的分子调控机制是什么？这些问题仍有待深入解答。

为了解决这些科学问题，刘天宇、孙思正等研究人员开展了一项创新性研究。他们首先成功构建了结直肠癌肝转移的阶梯式小鼠模型，通过脾被膜下注射HCT116和SW620结直肠癌细胞系，模拟肿瘤细胞从原发灶到肝脏定植的全过程。该模型经过连续三代(分别标记为P0、P1、P2)的体内筛选，肝转移灶数量逐代增加，细胞迁移和侵袭能力显著增强，上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)相关标志物表达也发生相应改变，证实了模型能够有效模拟肝转移进程的恶性演进。

在技术方法上，本研究采用了多组学整合分析策略：通过非靶向代谢组学(LC-MS/MS)检测肝转移组织代谢物变化；利用单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术分析来自16例结直肠癌患者的39个样本(包括原发灶、正常结肠、肝转移灶和正常肝脏)，共获得134,136个单细胞转录组；结合空间转录组学(Spatial Transcriptomics, ST)技术解析代谢表型的空间分布特征；最后通过体内药物干预实验(TGFβ抑制剂LY2157299和OXPHOS抑制剂IACS-010759)及体外细胞功能实验(Transwell实验和细胞耗氧率OCR测定)验证关键发现。

代谢组学揭示肝转移灶中TCA循环活性增强

研究人员首先通过代谢组学分析发现，与正常肝组织相比，结直肠癌肝转移组织表现出独特的代谢特征。主成分分析(PCA)显示，不同代次(P1和P2)的肝转移细胞代谢谱与正常肝细胞明显分离，而同一组内的代谢特征保持稳定，这不仅表明肝转移细胞发生了显著的代谢重编程，也验证了阶梯式肝转移模型的可靠性。

差异代谢物分析进一步揭示，在HCT116和SW620两种细胞系构建的肝转移模型中，第一代(P1)肝转移细胞均显示出三羧酸(Tricarboxylic Acid, TCA)循环的显著富集。值得注意的是，随着转移潜能的增强(P2代)，TCA循环代谢物表现出动态变化：柠檬酸(Citrate)和顺乌头酸(cis-Aconitate)逐渐消耗，而富马酸(Fumarate)和苹果酸(Malate)不断积累，同时NAD⁺利用增加，其前体NMN生成上升。这些变化提示TCA循环在肝转移细胞中被重新激活，线粒体氧化磷酸化功能逐渐增强。

定量分析结果进一步证实，随着代次增加，HCT116和SW620细胞中异柠檬酸水平和NAD⁺/NADH比值逐渐下降，而富马酸和苹果酸水平逐步升高。JC-1线粒体膜电位检测显示P2代细胞线粒体膜电位显著升高，表明线粒体活性明显增强。这些结果共同表明，随着转移性肿瘤侵袭能力的增强，线粒体OXPHOS功能逐步增强。

单细胞转录组测序鉴定CRC中的高OXPHOS亚型

为了在单细胞水平探究OXPHOS在结直肠癌转移过程中的变化，研究人员对公共数据库中的单细胞RNA测序数据进行了深入分析。经过严格的质量控制和批次效应校正后，共保留16例患者的37个样本，包含134,136个单细胞转录组。通过UMAP聚类，这些细胞被分为16个簇，并注释为7种主要细胞类型：T细胞、B细胞、上皮细胞、髓系细胞、成纤维细胞、内皮细胞和肥大细胞。

通过推断上皮细胞的拷贝数变异(CNV)，研究人员将上皮细胞分为恶性(19,769个细胞)和非恶性(18,955个细胞)两类。对恶性上皮细胞进行重新聚类后，获得16个恶性上皮亚群。利用scMetabolism软件对恶性上皮细胞的OXPHOS活性进行评分发现，高OXPHOS细胞主要分布在肝转移(LM)组中。基因集富集分析(GSEA)证实，OXPHOS通路在LM组中显著富集。

进一步分析发现，Malignant_03和Malignant_14是两个OXPHOS活性最高的细胞簇，分别来源于LM组和原发肿瘤(PT)组。功能富集分析显示，Malignant_14显著富集于适应性免疫反应、免疫球蛋白复合物、自然杀伤细胞介导的细胞毒性和趋化因子信号通路等相关通路，表明原发肿瘤具有较强的免疫细胞招募能力。而Malignant_03则主要富集于蛋白质折叠、细胞周期、糖酵解/糖异生和MAPK信号通路，提示肝转移灶具有更高的增殖活性和能量代谢需求。

构建高OXPHOS水平亚型的风险评分模型

为了评估高氧化磷酸化水平亚型在结直肠癌中的预后风险，研究人员分别针对Malignant_03和Malignant_14亚群构建了风险评分模型。以TCGA-COAD数据集作为训练集，GSE143985数据集作为验证集，通过单因素Cox回归分析和LASSO Cox回归模型，最终筛选出12个基因构建预后模型。

风险评分计算显示，在TCGA-COAD数据集中，高风险组患者(n=172)的生存曲线急剧下降，而低风险组患者生存曲线相对平缓，5年总生存率保持在75%以上。受试者工作特征曲线(ROC)分析显示，该模型对1年、3年和5年总生存期的预测曲线下面积(AUC)分别为0.845、0.772和0.769，表明模型具有良好的预测性能。在GSE143985验证集中，模型同样表现出理想的预测能力。

研究人员还发现，高风险评分与多种免疫检查点分子(如CD276、CEACAM1等)的表达呈负相关，表明与原发灶相比，肝转移灶可能具有独特的免疫逃逸能力。

Monocle2揭示恶性腺上皮细胞从糖酵解向OXPHOS的转变

为了解析结直肠癌腺上皮细胞的进化动态，研究人员使用Monocle2进行了伪时间分析，构建了包含四个分支的发育轨迹，描绘了从恶性上皮细胞到肝转移上皮细胞的发育路径。通过结合CytoTRACE评分评估分化潜能，确定Malignant_12簇分化潜能最低，位于轨迹左侧，为发育路径的起点。

将OXPHOS评分投射到轨迹上后，发现在分支点1附近出现分叉，形成两个细胞命运：Cell Fate 1(高OXPHOS水平)和Cell Fate 2(低OXPHOS水平)。OXPHOS水平最高的Malignant_03和Malignant_14主要位于Cell Fate 1内。更重要的是，研究发现OXPHOS与CytoTRACE评分在恶性腺上皮细胞中呈显著正相关，表明OXPHOS可能在结直肠癌肝转移中发挥关键作用。

富集分析显示，高OXPHOS亚型在DNA修复、外源物代谢、MYC信号和OXPHOS等方面显著富集，与患者的临床病理特征和增加的恶性程度相符。有趣的是，肝转移灶中OXPHOS的激活与其他代谢通路(包括脂肪酸代谢、糖酵解和胆固醇稳态)同时发生，反映了肿瘤细胞在转移过程中代谢重编程的高度可塑性。

BEAM分析显示，从初始状态向Cell Fate 1和Cell Fate 2转变过程中的驱动基因大多与OXPHOS相关。在伪时间轨迹中，关键OXPHOS基因(ATP5MC2、COX6C、NDUFB4、UQCR10)在Cell Fate 1中呈上升趋势，而在Cell Fate 2中则呈现先升后降的模式。相比之下，糖酵解在Cell Fate 1和Cell Fate 2中均呈现先下降后上升的趋势。这表明恶性腺上皮细胞在结直肠癌肝转移过程中发生了从糖酵解向OXPHOS的代谢转变。

高OXPHOS亚型在肿瘤微环境中的细胞间相互作用

为了探究高OXPHOS亚型在肿瘤微环境(Tumor Microenvironment, TME)中的调控信号通路变化，研究人员应用CellChat工具分析了细胞间通讯。结果显示，尽管LM组中主要细胞类型间的相互作用数量和强度高于PT组，但差异相对较小。在LM组中，高OXPHOS亚型与内皮细胞和成纤维细胞的相互作用更强，而与免疫细胞的相互作用则显著弱于PT组，表明LM组中的恶性上皮细胞具有更强的免疫逃逸能力和TME重塑能力。

进一步比较发现，高OXPHOS亚型特异性表达五个信号通路：VISFATIN、TGF-β、HSPG、EGF和AGRN。这些通路通过代谢调控、信号转导和微环境重塑等机制形成网络，共同驱动转移级联反应，其中TGF-β激活最为广泛。

空间转录组联合单细胞测序揭示高OXPHOS亚型的空间特征

为了验证高OXPHOS亚型的空间分布特征，研究人员利用公共数据库中的结直肠癌空间转录组数据进行了分析。通过Seurat软件将原发肿瘤样本分为0-14个亚群，并应用SPOTlight基于单细胞测序数据对空间转录组数据进行解卷积，可视化上皮细胞的空间分布。

通过AddModuleScore功能对Malignant_14的前20个基因进行评分发现，第8、9和11亚群与Malignant_14的相关性最强。基因集变异分析(GSVA)评估空间转录组数据中的OXPHOS水平显示，这些亚群的OXPHOS评分最高。单细胞通量估算分析(scFEA)估计了每个空间点的代谢通量率，CytoTRACE评估了上皮细胞的分化状态。结果显示，第8、9和11亚群不仅恶性程度更高，而且TCA循环活性显著增加。

使用PROGENy精确识别空间转录组数据中的关键通路变化，发现TGF-β通路在第8、9和11亚群中显著富集。在另一个肝转移样本中进行的相同分析验证了这些发现，证实高OXPHOS上皮亚型在空间水平上具有强大的侵袭潜力，且这一过程可能由TGF-β信号通路的激活驱动。

抑制TGFβ可抑制OXPHOS活性并减弱结直肠癌肝转移进展

为了阐明TGFβ与OXPHOS之间的调控机制，研究人员进行了体内外实验验证。在体内实验中，通过脾被膜下注射表达荧光素酶的HCT116-LMT-P2细胞建立裸鼠肝转移模型。将动物随机分为三组：LMT-P2细胞(对照组)、LMT-P2+TGFβ抑制剂(LY2157299)和LMT-P2+OXPHOS抑制剂(IACS-010759)。生物发光成像显示，LY2157299和IACS-010759均显著降低了肝转移的发光信号。组织病理学分析和转移灶计数进一步表明，OXPHOS抑制显著减少了肝转移数量。

体外Transwell实验显示，在相同处理条件下，两种抑制剂均显著减弱了HCT116细胞的迁移和侵袭能力。此外，HCT116和SW620细胞系的细胞耗氧率(OCR)测定表明，与LMT-P0细胞相比，LMT-P2细胞中的OXPHOS代谢显著升高，而LY2157299处理可明显降低这种升高。这些发现表明，TGFβ抑制通过下调OXPHOS代谢来抑制结直肠癌的肝转移。

研究结论与意义

本研究通过整合多组学技术和功能实验，系统揭示了结直肠癌肝转移过程中氧化磷酸化代谢重编程的关键作用及调控机制。主要研究结论包括：首先，结直肠癌肝转移细胞表现出独特的代谢特征，TCA循环活性增强，线粒体OXPHOS功能显著上调；其次，单细胞水平分析鉴定出高OXPHOS恶性上皮细胞亚型，该亚型在肝转移灶中富集且与不良预后相关；第三，伪时间轨迹分析表明，恶性上皮细胞在转移过程中发生了从糖酵解向OXPHOS的代谢转变；第四，细胞通讯分析揭示TGF-β信号通路在高OXPHOS亚型中特异性激活；最后，体内外实验证实抑制TGFβ可降低OXPHOS活性并减弱肝转移进展。

该研究的科学意义在于首次系统阐明了TGFβ-OXPHOS轴在结直肠癌肝转移中的调控作用，为理解肿瘤转移的代谢适应机制提供了新视角。临床转化价值在于发现了靶向线粒体代谢重编程抑制结直肠癌肝转移的新策略，为晚期结直肠癌患者提供了潜在的治疗靶点。特别是TGFβ抑制剂LY2157299(已在临床试验中应用)和OXPHOS抑制剂IACS-010759的联合使用，可能成为抑制结直肠癌肝转移的有效治疗组合。

本研究也存在一些局限性，如动物模型样本量有限，肝转移模型采用脾注射而非结肠黏膜注射，不能完全模拟病理相关的肝转移途径；不同患者间肿瘤细胞的异质性使得从单细胞测序数据中识别共同特征较为困难；单细胞和空间转录组数据并非来自同一患者，限制了空间转录组验证的稳健性。未来的研究可进一步扩大样本量，优化动物模型，并在同一患者中整合多组学数据，以更全面揭示结直肠癌肝转移的分子机制。

该研究成果发表于《Cancer & Metabolism》期刊，为结直肠癌肝转移的精准治疗提供了重要的理论依据和实验证据，对推动结直肠癌肝转移的代谢靶向治疗具有重要的科学价值和临床意义。