扰动条件下Ericaria amentacea叶片相关细菌群落结构的变化及其生态适应意义

本研究揭示了在海洋保护区不同干扰程度下，大型藻类Ericaria amentacea（隶属于Cystoseira sensu lato复合群）叶片附生细菌群落的数量与质量组成发生显著变化。研究发现，在保护程度较低（干扰较高）的区域，活菌丰度更高，且富含Lutibacter和Psychromonas等与藻类抗逆性相关的细菌属。这表明E. amentacea在面临干扰时，其附生细菌群落结构可能发生适应性调整，这或许是该藻类在干扰环境下仍能维持良好健康状态的关键机制。本研究为理解大型藻类-细菌互作在海洋生态系统适应环境变化中的作用提供了新见解。

　　

1 引言

大型藻类Cystoseira sensu lato复合群（墨角藻目；褐藻纲）是地中海潮间带和浅海基岩的优势藻类，形成复杂的三维冠层结构，即Cystoseira藻礁。这些藻礁为众多海洋生物提供了重要的栖息地、食物来源和繁殖场所，是地中海最高产和最多样化的生态系统之一，支撑着多项重要的生态服务功能。

近几十年来，由于气候变化和人为因素（如海岸开发、富营养化、沉积和污染）的影响，地中海地区的Cystoseira sensu lato藻礁已大规模衰退。这种严峻形势促使人们关注其面临的威胁，并开展了大量关于其维持和恢复的研究。成功的恢复需要综合生态、历史和生物信息，其中，了解影响该复合群藻类健康状态的关键生物和非生物因素至关重要。

细菌生物膜对大型藻类的生存至关重要，它们参与营养吸收与释放、次级代谢产物产生等多种生理过程。大型藻类与细菌的关联具有物种特异性，细菌已知可以调节藻类的防御能力，增强其对病原体的抵抗力和繁殖性能，从而显著影响其生存、繁殖和生长，尤其在受干扰条件下。通常，大型藻类通过产生酚类化合物、抗菌剂和抗氧化剂等化学物质，主动调节附生群落的丰富度和丰度，从而选择能够提高其对干扰环境耐受性的细菌菌株。

Cystoseira sensu lato复合群的藻类已知拥有广泛的内生和附生细菌群落。然而，关于这些群落的数量与质量特征及其在决定藻类生存、生长能力和健康状态中可能发挥的作用，目前尚不清楚，相关文献数据非常稀缺。因此，本研究旨在表征暴露于不同干扰水平的Cystoseira sensu lato复合群藻类的附生细菌群落，探究该群落的数量与质量组成与藻类健康状态之间的关系。研究假设是，与藻类所受干扰水平相关，其附生细菌群落结构会发生显著变化，并可能影响其健康状态。

2 材料与方法

2.1 研究区域、实验设计与采样活动

研究在意大利撒丁岛东北海岸的Tavolara Punta Coda Cavallo海洋保护区进行。该保护区内三个主要岛屿（Molarotto, Molara, Tavolara）的海岸线因受不同的保护制度（A区-完全保护，B区-一般保护，C区-部分保护）而呈现出不同的干扰水平。

首先，通过视觉普查评估了三个保护区内整个大型藻类群落的物种组成。在每个岛屿，沿海岸线设置3条50米长、10米宽的样带，并在每个样带内定义3个10平方米的亚样带，视觉估算每种藻类对基质的总覆盖率（分为四个等级：I <25%；II 25%–50%；III 50%–75%；IV >75%）。同时，应用改良版的LBRHI指数（本研究称为CyFHI - Cystoseira sensu lato藻礁健康指数）评估Cystoseira sensu lato藻礁的健康状况。该指数基于对藻礁不同特征（如活叶片、新生藻体、死组织、绿藻覆盖、无植被区域）的百分比覆盖度进行计算。

根据群落组成分析结果，确定Cystoseira属中最丰富且敏感的物种Ericaria amentacea为本研究的关键物种。随后，沿每个样带采集E. amentacea的藻体样本，用于其叶片相关微生物群落的定性和定量表征。

2.2 实验室工作——微生物群落的定性定量表征

2.2.1 样品收集与制备

采集的E. amentacea叶片样本经过处理以去除非附着微生物。每个叶片样本用过滤海水冲洗，然后使用无菌棉签用力擦拭叶片两面。将棉签头置于含有过滤海水的离心管中，涡旋混合，最终获得细菌悬浮液用于后续分析。

2.2.2 细菌计数

使用三种不同的荧光染料，通过荧光显微镜进行总细菌计数（细菌数/平方厘米）。使用DAPI染色计数总细菌；使用SYBR green和碘化丙啶混合染色区分活菌和死菌或受损细菌。

2.2.3 细菌DNA提取与定量

从细菌悬浮液中提取总DNA，对16S rRNA基因的V5–V6高变区进行PCR扩增。使用Illumina MiSeq平台进行测序。对获得的序列进行处理，使用DADA2算法以97%的序列一致性定义扩增子序列变异（ASVs），并利用RDP分类器对ASVs进行分类学注释。为比较多样性，对所有样本进行序列数标准化。

2.3 数据处理与分析

关于Cystoseira物种覆盖率和E. amentacea相关细菌群落丰度的数据，采用单因素方差分析（ANOVA）和Student-Newman-Keuls（SNK）检验进行单变量统计分析。细菌群落组成（以ASVs表示）采用多变量统计分析（PCA, PERMANOVA, SIMPER）。

3 结果

3.1 Cystoseira群落的丰度与质量

Cystoseira属藻类是三个岛屿所有样带中大型藻类群落的主要组成部分，覆盖率均在50%至75%之间（III级）。Cystoseira群落的健康状态在所有采样点均较高（CyFHI指数大于0.6）或至少良好（大于0.5），受损叶片数量少，褪绿现象极少。三个样带中最丰富的Cystoseira物种均为E. amentacea，且不同采样点间的藻体形态未发现显著差异。

就Cystoseira属的总覆盖率以及E. amentacea的覆盖率而言，三个岛屿之间未记录到统计学差异。但总体而言，Tavolara岛的覆盖率最高，而Molara岛的百分比覆盖率最低。

3.2 细菌群落的表征

关于E. amentacea叶片上的细菌丰度，在所有岛屿的样带中均观察到活菌数量高于死菌。此外，Molara、Molarotto和Tavolara岛屿之间在活菌和死菌数量上记录到一些显著差异。特别值得注意的是，Molara岛的活菌数量显著高于Molarotto和Tavolara岛。

关于E. amentacea叶片附生细菌群落的定性特征，在所考虑的样本中观察到超过127个ASVs。多维度标度（MDS）和PERMANOVA分析表明，三个不同岛屿的细菌群落组成存在显著差异。成对事后检验表明，Molara岛的附生细菌群落与其他岛屿的群落显著不同。SIMPER检验显示，Molara与Molarotto岛屿的附生群落相异性为68%，Molara与Tavolara为65%，而Molarotto与Tavolara之间的微生物群落相异性最低（32%）。具体分析群落分类组成发现，Lutibacter sp.（4.89%）和Psychromonas sp.（4.51%）在Molara岛采集的叶片上最为丰富，而在Molarotto和Tavolara岛则不那么具有代表性。

4 讨论

本研究为了解Cystoseira sensu lato复合群大型藻类附生细菌群落的组成及其在干扰条件下可能发生的结构变化提供了新的见解。

首先，分析Tavolara Punta Coda Cavallo海洋保护区内整个Cystoseira sensu lato群落或关键物种E. amentacea的基质覆盖率数据，在不同保护级别（即不同干扰程度）的岛屿之间未发现显著差异。尽管在保护程度较低的C区（Molara岛）观察到覆盖率略有下降，但这一下降并不显著。此外，在所有采样区域，Cystoseira群落均表现出高或良好的质量状态，高度敏感的物种E. amentacea不仅在A区和B区占优势，在保护水平较低的C区也同样如此。考虑到C区通常受到更多的人为压力，而Cystoseira sensu lato藻类，特别是E. amentacea，已知对环境压力相当敏感，这一结果有些出乎意料。这表明这些藻类的耐受性和恢复力可能比先前估计的要强。

藻体形态分析未发现岛屿间存在显著差异，因此可以排除藻体复杂性是造成细菌群落差异的主要原因。同时，所有区域藻类的良好健康状态表明，在Tavolara和Molarotto观察到的细菌丰度较低并非由于可定殖面积减少（如叶片受损），而Molara较高的细菌丰度也并非源于病弱藻体的细菌过度定殖。

据此可以推测，与保护水平（即干扰程度）相关的E. amentacea叶片附生细菌群落的显著定性定量差异，可能参与了这些大型藻类对干扰的响应。微生物在植物表面的定殖是一个动态过程，与环境条件密切相关。水生植物能够化学“培育”保护性微生物以增强其在干扰下的抵抗力。因此，在受到部分保护、潜在干扰更大的C区，E. amentacea种群可能通过调节其相关的细菌群落来启动防御机制，帮助其获得比其生理允许的更高的恢复力。这种调节可能由信息化学过程介导，在干扰条件下，藻类可能增加抗菌物质和植物化学物质的分泌，从而有利于选择那些能使它们在不利条件下维持生态最适状态的细菌类群。

细菌群落定性表征的结果也支持这一假设。在低保护区（Molara），一些已被描述为参与大型藻类抗逆性的细菌类群（如Lutibacter sp. 和 Psychromonas sp.）的丰度高于其他岛屿。Lutibacter sp. 属于黄杆菌科，已知在有机质降解和生物地球化学循环中发挥作用，其丰度增加可能代表了对富营养化和有机污染物的一种保护。Psychromonas sp. 的丰度则可能与藻类在胁迫下产生的藻酸盐等次级代谢产物有关，其存在可能由化学信号驱动。

综上所述，研究结果证明，在干扰情况下，与E. amentacea叶片相关的细菌群落结构发生了显著变化。可以合理地推测，在MPA的C区（Molara）观察到的该大型藻类的高丰度和良好健康状态，可能至少部分与其附生细菌群落分类组成的转变有关，这种转变可能参与了藻类对干扰的适应过程。然而，需要开展更聚焦和深入的研究来验证这一假设。