双价组蛋白修饰调控拟南芥伤口诱导胁迫响应中芥子油苷生物合成的时间性协调机制

本研究发现拟南芥中芥子油苷（GSL）生物合成基因受到兼具活性（组蛋白乙酰化）和抑制性（H3K27me3）组蛋白标记的双价染色质调控。PRC2复合体组分（CLF、SWN、LHP1）抑制GSL基因表达，其功能缺失会增强GSL积累。基因组分析显示，吲哚类和脂肪族GSL基因富含H3K27me3，且吲哚类基因还被活性组蛋白乙酰化标记。时间进程转录组和代谢组分析揭示，伤口胁迫下吲哚类GSL基因在早期被诱导，而脂肪族GSL基因在后期激活，表明双价组蛋白修饰在胁迫下协调了GSL途径的时间性基因表达。

　　

2.1 LHP1相关多梳抑制对芥子油苷代谢的表观遗传 suppression

作为固着生物，植物持续暴露于动态变化环境中的各种胁迫。除了热、干旱和伤口等非生物胁迫，还包括昆虫和病原体攻击等生物胁迫。固定生长的植物必须以比能移动的动物更受限的方式克服这些挑战。主要的植物防御策略之一是产生和利用次级代谢物，以提高生存、适应和恢复能力。例如，拟南芥所属的十字花科（Brassicaceae）家族产生一种特征性的次级代谢物——芥子油苷（GSLs），即含硫和氮的次级化合物。

虽然GSLs在生理条件下以基础水平合成，但在昆虫攻击和伤口暴露下其产量呈指数级增加。根据前体氨基酸，GSLs分为脂肪族、吲哚类和芳香族三类。例如，脂肪族GSLs衍生自蛋氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或谷氨酸；吲哚类GSLs衍生自色氨酸；而芳香族GSLs则来自苯丙氨酸和酪氨酸。GSLs的生物合成过程通常由三个阶段组成：（i）前体氨基酸的侧链延伸，（ii）核心结构形成，以及（iii）侧链的次级修饰，如羟基化、甲氧基化、氧化、去饱和或苯甲酰化。

表观遗传转录重编程不仅在植物发育程序中起关键作用，还参与植物代谢变化。本研究测试了组蛋白修饰剂是否参与GSL生物合成途径的控制，并选择了一个代表性的抑制复合物——PRC2。LHP1是PRC2复合体的重要组成部分，直接结合H3K27me3标记，并与核心PRC2复合体组分合作稳定抑制靶基因表达。因此，我们获得了相应的功能缺失突变体lhp1-4，并使用超高效液相色谱（UHPLC）方法测量了Col-0（野生型）和lhp1-4之间的GSLs水平。

在检测条件下，所有基因型中鉴定出五种脂肪族（4OHB、4MSOB、5MSOP、3-B和4MTB）、四种吲哚类（I3M、4OHI3M、4MOI3M和1MOI3M）和一种芳香族GSL化合物（2PE），尽管2PE的水平极低。在检测到的脂肪族GSL化合物中，4MTB水平最高，其次是4OHB和4MSOB。脂肪族GSL化合物的总量显著高于吲哚类GSL化合物，表明脂肪族GSL化合物在拟南芥幼苗中主要合成，而吲哚类GSLs的量相对较低。

我们比较了Col-0和lhp1-4突变体之间的内源GSL化合物水平。值得注意的是，所有五种脂肪族GSL化合物的水平在lhp1-4突变体中均显著高于Col-0，表明PRC2复合体是抑制脂肪族GSL生产所必需的。在吲哚类GSL化合物的情况下，三种GSL化合物如I3M、4MOI3M和1MOI3M在lhp1-4突变体中显著增加，而一种芳香族GSL化合物（2PE）在Col-0和lhp1-4突变体之间未显示显著变化。总的来说，lhp1-4突变体中脂肪族和吲哚类GSL化合物的水平均显著高于Col-0，表明PRC2复合体参与了GSL代谢过程。

2.2 lhp1-4突变体中MYB28/29/76的上调与增强的脂肪族芥子油苷生产相关

由于GSL化合物的量在lhp1-4突变体中显著升高，我们接下来通过定量逆转录PCR（qRT-PCR）检测GSL生物合成途径基因是否受LHP转录调控。GSL生物合成途径的基因调控网络主要由几个MYB转录因子（TF）基因协调。例如，MYB28、MYB29和MYB76参与脂肪族GSL生物合成，而MYB34、MYB51、MYB122和OBP2参与吲哚类GSL生产的调控。对于脂肪族GSL，MYB28、MYB29和MYB76基因在lhp1-4突变体中显著上调，表明编码MYB TFs的基因表达增加可能导致lhp1-4突变体中脂肪族GSL化合物相对于Col-0的增加。

在吲哚类GSL途径的情况下，MYB34的表达在lhp1-4突变体中适度增加，而MYB122未显示显著变化。MYB51的转录水平在lhp1-4突变体中反而下调，与先前研究显示MYB34和MYB51表达模式相反的结果一致。因此，即使MYB34和MYB51指定用于调控吲哚类GSLs，它们对防御反应的调控贡献可能因胁迫类型（即伤口、病原体和草食动物）、组织和发育阶段而异，这一推测需要进一步澄清。

2.3 脂肪族GSL途径基因在lhp1-4中广泛上调，而吲哚类途径调控仍复杂

脂肪族GSL途径相关TFs（MYB28、MYB29和MYB76）基因的上调使我们假设这些TFs介导的调控网络协调了脂肪族生产的转录重编程。为了测试这一点，我们在Col-0和lhp1-4突变体之间对从总共23个脂肪族GSL生物合成基因中随机选择的11个基因进行了qRT-PCR分析，这些基因包括脂肪族GSL生物合成的三个不同阶段。这包括两个“侧链延伸”阶段基因（MAM1和MAM3）、五个“核心结构形成”阶段基因（CYP79F1、CYP79F2、CYP83A1、SOT17/ST5c和SOT18/ST5b）以及四个“次级修饰”阶段基因（FMO GS-OX1、FMO GS-OX3、AOP1和AOP3）。

我们发现在lhp1-4突变体中，“侧链延伸”阶段基因（MAM1和MAM3）和“核心结构形成”阶段基因（CYP79F1、CYP79F2、CYP83A1和SOT18）显著上调，但SOT17在lhp1-4突变体中未显示显著变化。在涉及“次级修饰”的基因中，只有FMO GS-OX1在lhp1-4突变体中显著上调，而FMO GS-OX3、AOP1和AOP3基因未显示显著上调。总的来说，我们得出结论，功能性LHP1的缺失导致脂肪族GSL途径基因显著上调。

接下来，我们还在Col-0和lhp1-4突变体之间对从总共12个吲哚类GSL途径基因中随机选择的11个基因进行了qRT-PCR分析，这些基因包括吲哚类GSL生物合成的两个不同阶段。这包括六个涉及“核心结构形成”阶段基因（CYP79B2、CYP79B3、CYP83B1、GGP1、SUR1和SOT16）和五个与“次级修饰”阶段基因相关的基因（CYP81F2、CYP81F3、CYP81F4、IGMT1和IGMT2）。大部分吲哚类GSL途径基因在lhp1-4突变体中未受显著影响。例如，五个基因如CYP79B3、SUR1、CYP81F4、IGMT1和IGMT2在lhp1-4突变体中上调，而其他六个基因（CYP79B2、CYP83B1、GGP1、SOT16、CYP81F2和CYP81F3）在lhp1-4突变体中基本未受影响或在某些情况下下调。关于这一观察，拟南芥中吲哚类GSL途径可能存在比脂肪族GSL途径更复杂的调控系统。总的来说，尽管吲哚类GSL化合物的水平在lhp1-4中升高，但功能性PRC2的缺失导致吲哚类GSL生物合成途径基因表达的动态改变，可能需要进一步澄清。

2.4 LHP1过表达对lhp1-4的功能互补恢复GSL水平和基因表达

为了确认LHP1功能缺失是GSLs量增加的原因，我们进行了qRT-PCR以测量Col-0和lhp1-4突变体背景中LHP1过表达转基因系35S::LHP1/lhp1-4之间GSL途径基因的转录水平。结果，lhp1-4突变体中的大多数缓解基因在35S::LHP1/lhp1-4转基因系中被显著抑制。这些结果证实，含有LHP1的表观遗传抑制子PRC2复合体抑制了GSLs的生物合成。此外，我们还测量了Col-0和35S::LHP1/lhp1-4转基因系之间的GSL化合物量。35S::LHP1/lhp1-4转基因系显示脂肪族和吲哚类GSL化合物的水平显著降低，与Col-0相当。

2.5 PRC2通过直接沉积H3K27me3在MYB调控因子和生物合成基因上抑制脂肪族芥子油苷生物合成

PRC2复合体催化抑制性组蛋白标记H3K27me3在靶基因染色质上的沉积。因此，我们推断PRC2复合体通过将H3K27me3沉积到MYB TF基因的基因组位点来抑制脂肪族和吲哚类GSL途径基因的转录，从而触发转录信号级联。为了测试这一点，我们分析了H3K27me3 ChIP-seq谱以获取H2K27me3富集的全局景观。我们的分析显示，所有五个在脂肪族GSL途径中起作用的MYB TFs均显示强烈的H3K27me3富集，表明LHP1通过沉积H3K27me3直接抑制这些MYB TFs的表达。

除了MYB TF基因，在七个“核心结构形成”基因中，五个基因（71%）（CYP79F1、CYP79F2、CYP83A1、GSTF11和GSTU20）富含H3K27me3，证实PRC2复合体不仅直接抑制MYB TF基因的表达，还通过沉积H3K27me3抑制许多“核心结构形成”基因的表达。同时，SOT17和SOT18基因区域显示很少的H3K27me3富集，表明它们不太可能受PRC2介导的抑制直接调控。

在“核心结构形成”阶段之后，脂肪族GSL化合物经历侧链的“次级修饰”。甲基硫代烷基GSLs（例如4MTB）被氧化成甲基亚磺酰烷基GSLs（例如4MSOB），这是由一组黄素单加氧酶（称为FMO GS-OX1和FMO GS-OX3）介导的。甲基亚磺酰烷基GSLs然后被氧化成烯基（例如3-B）或羟烷基GSLs（例如4OHB），这是由α-酮戊二酸依赖的双加氧酶如AOP3介导的。我们发现H3K27me3在脂肪族GSL途径的所有“次级修饰”阶段基因（FMO GS-OX1、FMO GS-OX3和AOP3）的基因区域上显著富集。尽管我们观察到FMO GS-OX1基因在lhp1-4突变体中上调，但FMO GS-OX3和AOP3基因在lhp1-4中未受显著影响。因此，需要进一步澄清为什么这两个基因在拟南芥中PRC2功能缺失时未受影响。总的来说，这些数据表明，大多数“核心功能形成”和一些“次级修饰”阶段基因在拟南芥中受含有LHP1的PRC2复合体介导的表观遗传抑制。

2.6 PRC2介导的H3K27me3抑制吲哚类GSL途径中的TFs和次级修饰基因

吲哚类GSL化合物经历“核心结构形成”和“次级修饰”阶段。吲哚-3-基甲基GSL（即I3M）被羟基化为1-羟基吲哚-3-基甲基GSL（即1OHI3M）或4-羟基吲哚-3-基甲基GSL（即4OHI3M），这是由CYP81F2~CYP81F4酶介导的。这些羟基吲哚GSLs进一步甲基化形成甲氧基吲哚GSLs，这是由IGMT1和IGMT2介导的。我们的H3K27me3 ChIP-seq分析显示，三个在吲哚类GSL途径中起作用的MYB和OBP2 TFs高度富含H3K27me3，表明PRC2通过沉积H3K27me3直接抑制这些MYB TF基因的表达。

在吲哚类GSL途径的八个“核心结构形成”基因中，只有CYP79B2和CYP79B3被发现显著富含H3K27me3，而CYP83B1、GGP1、SUR1、SOT16、GSTF9和GSTF10基因的基因区域有很少的H3K27me3。接下来，我们还检查了H3K27me3在吲哚类GSL途径中“次级修饰”基因上的富集。我们鉴定出所有五个基因（100%），如CYP81F2、CYP81F3、CYP81F4、IGMT1和IGMT2，均高度富含H3K27me3。这表明吲哚类GSL途径中的“次级修饰”阶段基因在拟南芥中受到PRC2复合体的强烈抑制。总的来说，H3K27me3分析证实，脂肪族和吲哚类GSL途径基因的表达，特别是“TFs”和“次级修饰”阶段基因，可能受到PRC2介导的H3K27me3的严格控制。

2.7 GSL生物合成基因的稳定抑制需要PRC2介导的H3K27me3沉积

为了确认LHP1是靶GSL途径基因稳定抑制的重要组分，我们还分析了LHP1的全局DNA结合谱。大多数在lhp1-4突变体中表达升高的GSL途径基因与相应的输入信号强度相比富含LHP1结合信号。因此，PRC2复合体介导的抑制可能参与了脂肪族和吲哚类GSL生产相关GSL途径基因的表观遗传抑制。

PRC2复合体是靶基因H3K27me3沉积和稳定维持所必需的。我们假设CLF和/或SWN（PRC2复合体中两个主要的H3K27甲基转移酶基因）的缺失可能导致PRC2靶向GSL途径基因上H3K27me3维持的缺陷。因此，我们分析了Col-0和clf; swn突变体背景之间的H3K27me3占据情况。在Col-0中富含H3K27me3的GSL途径基因在clf; swn突变体中显示严重的H3K27me3耗竭。

除了PRC2复合体的核心组分CLF和SWN，我们还测试了另一个PRC2组分LHP1是否影响GSL途径基因上的H3K27me3富集。使用H3K27me3抗体在Col-0和lhp1-4突变体之间进行了ChIP-qPCR分析。结果显示，测试基因上的H3K27me3富集在lhp1-4中显著减少。此外，我们分析了一个公开可用的ChIP-seq数据集，比较了Col-0和lhp1-4之间的H3K27me3水平。与clf; swn突变体相对于Col-0所示结果相似，许多GSL途径基因上的H3K27me3富集在lhp1-4突变体中大幅减少。这些结果证实LHP1是拟南芥中GSL途径基因适当富集H3K27me3所必需的。总的来说，这些结果支持我们的发现，即PRC2是GSL途径基因上H3K27me3富集所必需的。

2.8 GSL途径基因受抑制性和活性组蛋白修饰的共同调控

表观遗传基因抑制不仅是与H3K27me3相关的协调行动，还涉及其他组蛋白甲基化，包括H3K9me2，它在DNA甲基化的基因组背景（如转座因子和重复序列）中高度积累。为了测试H3K9me2是否参与GSL途径基因的抑制，我们分析了其全局富集模式，发现46个GSL途径基因中没有一个显示H3K9me2富集，这表明H3K9me2介导的抑制不作用于GSL途径基因的转录调控。

与抑制性H3K27me3和H3K9me2标记相反，一些组蛋白标记与基因激活相关。它们包括组蛋白某些残基的甲基化和乙酰化，如H3K4me3、H3K36me3和H3ac。为了检查活性组蛋白修饰是否参与GSL途径基因的转录，我们分析了多个组蛋白激活标记的全局谱，包括H3组蛋白甲基化（H3K4me3和H3K36me3）和H3乙酰化（H3K9ac、H3K14ac、H3K23ac和H3K36ac）。

H3K4me3标记在“核心结构形成”阶段基因（12/17，71%）中富集最高，在“侧链延伸”（4/10，40%）和“转录因子（TF）”基因（2/9，22%）中富集较低。相比之下，H3K4me3标记在“次级修饰”阶段基因（0/10，0%）中未检测到。H3K36me3标记仅在“侧链延伸”（4/10，40%）和“核心结构形成”阶段基因（9/17，53%）中检测到。H3ac标记在所有基因组中检测到，在“TF基因”（22%，2/9）、“侧链延伸”（40%，4/10）、“核心结构形成”（76%，13/17）和“次级修饰”阶段基因（40%，4/10）中观察到富集。在H2Bub1标记的情况下，它仅在“侧链延伸”（3/10，30%）和“核心结构形成”（2/17，12%）阶段基因中以低水平检测到，在“TF基因”或“次级修饰”阶段基因中未检测到。这表明H2Bub1不是GSL途径基因激活的主要贡献者。

我们注意到，“核心结构形成”阶段基因（76%，13/17）显示H3ac富集基因的百分比最高，当与其他基因组如“转录因子”（22%，2/9）、“侧链延伸”（40%，4/10）和“次级修饰”（40%，4/10）相比时。有趣的是，“核心结构形成”阶段基因显示H3K27me3的低富集（41%，7/17）在GSL途径基因中。这些数据表明，“核心结构形成”阶段基因最高度富集活性标记H3ac，且低占据抑制标记H3K27me3。因此，我们通过分析Col-0的RNA-seq数据调查了H3ac富集和H3K27me3耗竭的染色质背景是否影响“核心结构形成”阶段基因的表达。结果，“核心结构形成”基因显示最高的平均转录水平，可能反映了其染色质背景的影响。此外，当比较“核心结构形成”阶段内脂肪族和吲哚类GSL基因之间的H3ac富集时，大部分吲哚类GSL基因显示显著高于其脂肪族对应物的转录水平。总的来说，这些发现表明GSL途径基因不仅受抑制性组蛋白修饰调控，还受激活性修饰调控。

2.9 双价染色质标记在吲哚类而非脂肪族GSL途径基因中高度富集

我们的表观基因组数据集分析表明，与脂肪族GSL途径基因相比，吲哚类GSL途径基因拥有相对较高比例的双价组蛋白标记。为了调查双价组蛋白修饰的存在，我们使用抗H3K27me3（抑制性）和抗H3ac（活性）标记进行了顺序ChIP分析。总共检查了14个选定的GSL基因（9个脂肪族和5个吲哚类GSL基因）的两个对立组蛋白标记H3K27me3和H3ac的双价状态。开花位点C（FLC）被用作阳性对照基因，因为FLC被报道拥有这些双价组蛋白标记。

结果，我们发现所有测试的九个脂肪族GSL基因未显示显著的双价组蛋白标记富集。同时，测试的五个吲哚类GSL基因在其基因组区域上显示显著的双价组蛋白标记富集。这些结果表明，与脂肪族GSL基因相比，吲哚类GSL基因在其染色质上拥有高比例的双价组蛋白状态，这可能使它们在伤口胁迫下能够快速诱导。

2.10 吲哚类和脂肪族GSL基因在伤口响应中表现出不同的时间表达动态

我们迄今为止的数据表明，脂肪族和吲哚类GSL途径基因受到独特和双价的组蛋白修饰，这可能导致动态转录变化。与此一致，我们假设脂肪族和吲哚类GSL途径基因可能受不同的转录协调。为了测试这一点，我们在Col-0中在伤口处理后6小时、12小时、24小时、72小时和120小时进行了时间进程RNA测序（RNA-seq）分析。RNA-seq样本的多维缩放（MDS）图分析显示每个样本组内生物重复紧密聚类，表明我们的RNA-seq样本具有高重复性。

我们在每个受伤时间点样本中进行了差异表达基因（DEG）分析，相对于未处理的0小时对照，揭示了数千个差异表达基因（DEGs）。在五个时间点中，最早的时间点6小时显示最剧烈的转录变化（2276个DEGs上调和3609个DEGs下调）。与其他时间点相比，6小时时更大比例（25.9%，2036/7858）的DEGs被独特识别；12小时为4.6%，24小时为3.8%，72小时为2.9%，120小时为1.4%。这些数据表明，伤口后的转录组变化以非常快速的方式发生，在6小时内，并在后期时间点逐渐缓解。

我们的7858个DEGs的聚类分析基于它们的表达模式识别了20个簇，这些簇表现出不同的表达谱。在总共46个GSL途径基因中，28个基因（61%）在时间进程RNA-seq的DEGs中发现。有趣的是，七个吲哚类GSL和14个脂肪族GSL途径基因落入明显不同的簇中。例如，47%（7/15）的吲哚类GSL途径基因落入C6、C7、C8或C9簇，这些簇显示早期（6小时或12小时）快速增加，然后在后期时间点逐渐减少。同时，42%（14/33）的脂肪族GSL途径基因在C1、C2、C3或C13簇中发现，这些簇显示6小时时瞬时减少，并在后期时间点增加。这些结果表明，吲哚类GSL途径基因是早期可诱导的，而脂肪族GSL途径基因是后期可诱导的。为了验证这一观察，我们还对三个脂肪族GSL途径基因（如MYB28、CYP83A1和BCAT4）和三个吲哚类GSL途径基因（如MYB34、CYP79B2和SOT16）沿六个伤口时间点进行了qRT-PCR分析。这些GSL基因沿伤口时间进程的表达模式模拟了RNA-seq的结果。

接下来，我们想知道脂肪族和吲哚类GSL途径基因之间的不同表达模式是否导致脂肪族和吲哚类GSLs之间的不同生产。为了检查这一点，我们量化了沿八个不同（0、1、6、12、24、72、120和168小时）伤口时间点之间未受伤时间点样本和处理时间点样本的GSLs水平。由于代谢物积累通常发生在转录变化之后，由于酶稳定性、代谢通量以及储存或降解过程等因素，我们在代谢物分析中包括了一个额外的168小时时间点。

结果，与未受伤时间点样本相比，受伤样本显示总脂肪族和吲哚类GSLs的生产增加。特别是，吲哚类GSL化合物的水平比脂肪族GSLs更早诱导（从伤口后12小时开始），表现出与时间点RNA-seq数据集相似的 pattern。在五种脂肪族GSL化合物中，三种脂肪族GSLs如4MSOB、5MSOP和4OHB表现出延迟诱导模式，而其他两种脂肪族GSL化合物如4MTB和3-B沿伤口时间点未显示任何显著变化。在吲哚类GSL化合物的情况下，四种个体吲哚类GSLs（I3M、4OHI3M、4MOI3M和1MOI3M）显示 slightly different induction patterns but were commonly induced early, from around 6 to 24 hours after wounding, compared to the aliphatic GSL compounds.

基于这些发现，我们提出了一个示意图模型，说明吲哚类和脂肪族GSL生物合成途径在伤口响应中的动态转录行为。吲哚类GSL途径基因的快速诱导表明它们的双价染色质配置，标记有H3K27me3和H3ac，可能促进快速转录激活和吲哚类GSLs的早期生产。相比之下，许多脂肪族GSL途径基因缺乏活性组蛋白标记，如H3ac。H3ac的较低富集可能延迟从抑制性染色质状态（富含H3K27me3）到活性状态的转变，导致脂肪族GSL基因的较慢和更 gradual activation以及脂肪族GSLs的延迟积累。 together, our results demonstrate that the distinct histone modification landscapes between aliphatic and indolic GSL genes contribute to their differential transcriptional timing, ultimately producing temporally separated peaks of GSL accumulation in Arabidopsis upon wounding.