基于新一代测序技术的哈佩雕迁地保护微卫星标记开发与应用研究

本文开发并验证了哈佩雕（Harpia harpyja）特异性微卫星标记，利用新一代测序技术（NGS）建立高效基因分型流程，为濒危物种迁地保护（ex situ conservation）提供精准遗传管理工具。研究表明，10个高多态性微卫星位点可实现个体识别（>95%准确率）和亲缘关系分析，结合性别分子标记，显著提升圈养种群繁殖配对科学性，对维持遗传多样性、防止近交衰退具有重要实践意义。

　　

ABSTRACT

哈佩雕（Harpia harpyja）作为新热带区最大的猛禽之一，已被世界自然保护联盟（IUCN）列为易危物种，其野生种群面临栖息地丧失和狩猎等威胁。尽管就地保护（in situ conservation）行动至关重要，但迁地保护（ex situ conservation）同样不可或缺。为有效管理圈养种群，需通过遗传手段避免近亲繁殖和遗传多样性丧失。本研究采用新一代测序策略，开发了哈佩雕特异性微卫星引物，并在巴西动物园和保护机构的圈养个体中进行了验证。通过10个高多态性微卫星位点，实现了对个体亲缘关系和身份的高精度识别（>95%），并开发了统计检验方法进一步优化关系估计。结合可靠的性别标记，这套微卫星标记为哈佩雕的迁地管理提供了科学依据。

1 引言

哈佩雕属鹰科，分布遍及中南美洲的密林地带。近年来，其种群数量因生境破碎化和人为捕杀而急剧下降。IUCN预测未来三代内种群可能减少50%。目前，针对该物种的保护措施包括就地保护（如巢区监护）和迁地保护（如受伤个体救助与繁育）。自1999年起，巴西的哈佩雕圈养繁殖已取得一定成功，但配对选择仍依赖行为兼容性和形态学数据，缺乏遗传信息支持，易导致近交或错误配对。

微卫星（SSR）作为共显性、高变异的分子标记，广泛应用于个体识别和亲缘关系分析。以往研究多采用异种转移标记，但由于物种间遗传差异，其准确性受限。新一代测序平台与生物信息学流程的发展，使得物种特异性微卫星的开发更加高效、经济。本研究旨在开发哈佩雕专属微卫星标记，构建分子工具箱，以支持其迁地种群遗传管理。

2 材料与方法

2.1 新微卫星开发

从哈佩雕血液样本中提取DNA，通过双酶切ddRADseq方法构建基因组文库，并在Ion Torrent PGM平台上测序。利用QDD3流程筛选含微卫星的序列，设计并验证了19对引物，最终选出17对用于后续基因分型。

2.2 样本与DNA提取

研究共纳入25只圈养个体（23只野生来源，2只圈养出生），覆盖亚马逊雨林、大西洋森林等多个地理种群。DNA提取采用Qiagen试剂盒，并通过分子方法进行性别鉴定。

2.3 测序文库构建

通过多重PCR扩增17个微卫星位点，连接Ion Torrent测序接头，构建测序文库。经乳化PCR和芯片加载后，在Ion Torrent PGM平台上完成测序。

2.4 基因分型与统计分析

使用FDSTools进行基因分型，生成四种数据集（FullLength、RepeatFocused、SSRs和CAT）。通过Arlequin、FSTAT和GenAlEx等软件计算遗传多样性参数、排除概率和身份识别概率。利用ML-Relate进行亲缘关系分析，并通过似然比检验和Bonferroni校正验证关系分类。

3 结果

3.1 微卫星特征

从14.1万条测序reads中筛选出1020个微卫星序列，以二核苷酸重复为主（78.52%）。最终10个位点被选中，平均等位基因数4.4个，观测杂合度（H_O）和期望杂合度（H_E）分别为0.3636和0.4534。四个位点（Hha02、Hha03、Hha06、Hha09）偏离哈迪-温伯格平衡（HWE），可能与瓦伦德效应有关。

3.2 个体识别与亲缘排除

所有位点的联合亲权排除概率（QC）达0.9946，个体识别概率（IC）为2.0362×10^?5。仅需四个位点即可实现同等精度。在24个个体中，明确鉴定出19对具亲缘关系的个体（13对全同胞、6对亲子），包括一组已知家庭（HZ12、HZ13及其后代HZ15、HZ16）。其中HZ13与HZ16的关系系数（r = 0.7651）被误判为全同胞，反映了低多样性位点对亲缘分类的挑战。

3.3 地理关联与遗传结构

亲缘个体多来自地理邻近区域（如帕拉州内部或与阿马帕州交界），支持哈佩雕存在长距离扩散能力。未知来源个体与已知地理种群亦存在遗传关联，凸显分子数据在配对管理中的必要性。

4 讨论

本研究开发的微卫星标记体系显著提升了哈佩雕圈养种群遗传管理的精准度。与异种标记相比，物种特异性标记更可靠，且新一代测序流程大幅提高了效率。低遗传多样性结果与历史研究一致，反映了该物种的遗传瓶颈，需通过科学管理避免多样性进一步丧失。

性别鉴定与微卫星分析的结合，可纠正传统形态学鉴定的误差（如同性配对），优化繁殖策略。亲缘关系分析中的模糊案例（如部分半同胞关系）需结合置信区间和假设检验谨慎解读，避免近交风险。

未来建议将全数圈养个体纳入遗传筛查，建立包含行为、地理来源和遗传信息的个体档案，以实现种群管理的最大效益。此外，维持自然遗传结构（如亚马逊南北种群分化）对保护本地适应性至关重要，应在放归计划中予以考虑。

伦理声明

本研究所有样本均由合作动物园兽医在常规操作中采集，符合巴西生物多样性管理法规（SISBIO #31457-6），并在国家遗传资源管理系统（SISGEN）注册（AC7C51E）。