利用亚纳米直径孔洞进行单酸分辨率的肽序列分析

《Advanced Functional Materials》：Peptide Sequencing With Single Acid Resolution Using a Sub-Nanometer Diameter Pore

本研究开发了一种基于亚纳米孔道的直接多肽测序技术。通过高能电子束在硅膜上蚀刻出亚纳米孔道，施加电场驱动变性多肽通过孔道，监测离子电流的阻断波动。结合分子动力学模拟和机器学习算法（如亲和传播和动态时间卷积），成功实现了β淀粉样蛋白Aβ1-42及其突变体（如北极突变E22G和糖基化S26O-GlcNAc）的单氨基酸分辨率测序，灵敏度和动态范围显著优于传统质谱技术。

　　随着医学对疾病早期诊断和治疗效果监测需求的不断提升，识别疾病相关的生物标志物成为一项关键任务。传统的方法如质谱分析（LC-MS/MS）虽然在蛋白质研究中具有重要地位，但其在高灵敏度和动态范围方面存在局限。这种技术主要通过分析短片段来识别肽的结构，无法直接读取完整的氨基酸序列，导致识别精度受限。此外，质谱仪的检测限通常在480飞克（fg）左右，仅能检测到浓度较高的蛋白质，这使得低丰度肽的识别变得困难。因此，科学家们正在探索一种全新的方法，能够以极高的灵敏度和动态范围直接读取肽的氨基酸序列，从而实现更精确的诊断和分析。

一种基于纳米流体技术的工具正在逐步展现出其独特的优势。该工具使用了一种直径在亚纳米尺度上的孔道，贯穿一层几纳米厚的非晶硅（a-Si）膜，从而形成所谓的“亚纳米孔”。当一个变性肽被施加高电场推过该亚纳米孔时，会部分阻断孔道中的离子电流。通过测量这种电流阻断的波动，可以读取氨基酸序列。为了实现这一目标，科学家们引入了分子动力学（MD）模拟，结合了如氨基酸体积、电荷、移动性以及附近水分子等预测因子，来解析波动的幅度和时间。这种方法在研究阿尔茨海默病（AD）的生物标志物——如淀粉样蛋白β（Aβ）的片段及其特定的翻译后修饰（PTMs）和点突变——中得到了验证。

为了提高读取的准确性和效率，亚纳米孔的制造和表征技术也在不断优化。例如，通过使用高能电子束在扫描透射电子显微镜（STEM）中精确地在非晶硅膜上蚀刻出一个亚纳米尺度的孔道。这些孔道具有双锥形结构，直径约为0.3–0.4纳米，为读取单个氨基酸提供了物理上的可能性。此外，为了确保孔道的电学特性不受干扰，膜的厚度和结构也进行了精确控制，避免了由于孔道结构不均匀而导致的测量误差。

在实际操作中，当一个变性肽被推过亚纳米孔时，电场在孔道轴线上被高度集中，从而产生一个相对较大的电泳力（约25–30皮牛，pN），促使肽在孔道中以相对均匀的速度移动。为了减少电荷的干扰，科学家们在孔道周围引入了水分子，使得孔道的电势分布更加均匀，避免了电流的波动。同时，为了提升信号的清晰度，测量时采用了高带宽（1.8兆赫兹，MHz）的信号采集，并以高采样率（3.6百万次每秒，MS/s）记录数据，这有助于捕捉到更精细的波动模式。

此外，为了进一步提升读取的准确性，研究人员还利用了聚二甲基硅氧烷（PDMS）等材料对膜进行包覆，从而减少电容性噪声。这种材料的引入不仅降低了信号的背景噪声，还提高了测量的信噪比（SNR）。同时，利用动态时间扭曲（DTW）算法对信号进行对齐，使得波动模式能够与MD模拟中的预测值进行对比。通过这种方式，科学家们能够对每个氨基酸进行精确的识别，即使是在低浓度和高噪声的环境下也能实现。

在实际应用中，该方法不仅能够读取单个肽的氨基酸序列，还能区分不同肽的变体。例如，Aβ1?42与它的突变体E22G以及糖基化修饰的S26OGlcNAc和磷酸化修饰的S26OPO3之间，通过MD模拟和DTW算法的结合，能够准确地识别其差异。此外，为了验证该方法的可靠性，科学家们还构建了一个“目标-诱饵”数据库，该数据库包括了所有符合长度要求（40–44个氨基酸）的人类肽序列。通过对这些虚拟肽进行模拟，研究人员能够判断出真实肽的排名，确保了识别的准确性。

为了进一步提高该方法的灵敏度，科学家们还在实验中采用了多种技术。例如，通过使用PDMS材料包覆膜，可以显著降低电容性噪声。此外，采用多通道微流控装置（如MinION流细胞）能够提高数据采集的效率。在实际实验中，研究人员将肽溶液注入微流控系统，使其在亚纳米孔中移动，并记录电流的变化。通过调整电压和电场强度，研究人员能够精确地控制肽的移动速度，从而获得更清晰的信号。

此外，为了减少测量中的随机噪声，研究人员还采用了信号平均技术。通过将多个相似波动模式的电流信号进行叠加和滤波，能够提高信号的信噪比。同时，利用动态时间扭曲（DTW）算法对信号进行对齐，使得不同通道中的数据能够相互校准，从而提高整体的识别精度。这些技术的结合使得科学家们能够以极高的灵敏度和动态范围读取肽的氨基酸序列，并能够区分不同修饰的肽。

在实际操作中，研究人员还发现了一些重要的问题。例如，某些氨基酸（如甘氨酸）在测量中经常被高估，而其他氨基酸（如苯丙氨酸和亮氨酸）则被低估。这表明，尽管该方法在理论上能够实现高精度的读取，但在实际应用中仍存在一些局限性。例如，某些氨基酸的移动性可能影响其在孔道中的停留时间，从而导致信号的波动模式发生变化。此外，某些修饰（如磷酸化）可能对信号的波动幅度影响较小，导致其难以被准确识别。

为了克服这些局限性，研究人员还进行了深入的分析。例如，通过比较不同氨基酸的波动模式，发现某些氨基酸（如甘氨酸）的波动幅度与MD模拟的预测值存在显著差异。这可能与氨基酸的体积、电荷以及周围水分子的数量有关。因此，为了提高识别的准确性，科学家们需要对这些因素进行更细致的分析，并调整实验条件以减少误差。

此外，为了验证该方法的可行性，科学家们还进行了多组实验。例如，使用不同结构的亚纳米孔进行测量，并比较其对信号波动的影响。实验结果表明，亚纳米孔的结构和尺寸对信号的波动模式具有重要影响。通过优化这些参数，研究人员能够提高信号的分辨率和准确性。同时，通过对不同修饰的肽进行测量，发现某些修饰（如糖基化和磷酸化）对信号的波动幅度有显著影响，而其他修饰则影响较小。

总之，这种基于亚纳米孔的读取技术为肽的氨基酸序列识别提供了一种新的方法。通过结合MD模拟、DTW算法和信号平均技术，研究人员能够以极高的灵敏度和动态范围读取肽的序列，并能够区分不同修饰的肽。尽管在实际应用中仍存在一些挑战，但这些技术的结合使得该方法在疾病诊断和治疗监测中具有广阔的应用前景。