壳聚糖-聚乙烯醇固定化纤维素酶在再生纸可持续生物脱墨中的应用研究

本文系统研究了纤维素酶在壳聚糖-聚乙烯醇（Cs/PVA/Ga）生物聚合物微球中的固定化技术及其在再生纸脱墨中的应用。通过戊二醛交联构建的固定化酶体系展现出优异的催化稳定性（80°C处理60分钟后仍保持83%活性）和重复使用性（7次循环后活性保留90%）。该技术将酶最适pH从5提升至8，最适温度从50°C提高至60-70°C，Km值从0.75 mM降至0.4 mM，显著增强了酶与底物的亲和力。研究证实固定化酶在10%纸浆浓度下仍能有效降解纤维素/半纤维素，为造纸工业提供了绿色可持续的解决方案。

　　

形态学表征

扫描电子显微镜分析显示，Cs/PVA/Ga和纤维素酶@Cs/PVA/Ga均呈现典型的微球结构。通过ImageJ软件进行粒径分析，Cs/PVA/Ga的平均直径约为495纳米，而纤维素酶@Cs/PVA/Ga的平均直径约为350纳米。对照组微球的尺寸分布范围为0.29至0.89微米，固定化酶微球为0.21至0.65微米。戊二醛的引入增强了PVA/CS共混物的机械性能，通过形成希夫碱共价键、缩醛桥以及氢键网络的重组，显著提高了微球结构的稳定性。

傅里叶变换红外光谱分析

FTIR光谱在3433 cm^-1处显示O-H伸缩振动峰，3333 cm^-1处为N-H伸缩振动峰。3100 cm^-1处的吸收峰归因于芳香结构的C-H伸缩振动。1163 cm^-1和1400 cm^-1处的特征峰分别对应C-O和C-N伸缩振动。1640 cm^-1处的吸收峰为壳聚糖酰胺基团的C=O伸缩振动，而1611 cm^-1处的C=N亚胺键证实了戊二醛与壳聚糖氨基的成功交联。

最适pH和温度测定

研究发现游离纤维素酶的最适pH为5，而固定化酶的最适pH转移至8。在温度适应性方面，游离酶的最适温度为50°C，固定化酶的最佳活性区间提升至60-70°C。这种变化可能与固定化过程中形成的微环境有关，共固定化策略有效增强了酶的碱性耐受性。

酶动力学研究

以羧甲基纤维素为底物进行动力学分析，游离纤维素酶的Km值为0.75 mM，Vmax为25.5 μmol·min^-1·mg^-1；固定化酶的Km值降低至0.4 mM，Vmax为18.7 μmol·min^-1·mg^-1。Km值的降低表明固定化显著提高了酶与底物的亲和力，这可能是由于固定化减少了空间位阻效应。

热稳定性和储存稳定性

热稳定性实验显示，在80°C处理60分钟后，游离酶仅保留50%活性，而固定化酶仍保持83%活性。储存稳定性方面，游离酶在14天后活性降至73%，固定化酶则保持95%活性。这些数据证实固定化有效增强了酶的结构稳定性。

热失活与热力学参数

通过阿伦尼乌斯图计算得到游离酶的活化能（Ea）为55.89 kJ·mol^-1，固定化酶为47.95 kJ·mol^-1。在不同温度下（333.15K、343.15K、353.15K），固定化酶的吉布斯自由能变（ΔG）均高于游离酶，表明固定化酶需要更多能量才能发生热失活。熵变（ΔS）的负值说明两种酶在热失活过程中均发生构象变化而未出现聚集。

固定化酶的重复使用性

在连续使用7次后，固定化酶的活性保留率为77%；而非连续使用（每次使用后4°C储存过夜）的活性保留率达90%。这种差异可能与酶结构的重折叠能力有关，低温储存有利于酶活性中心的恢复。

脱墨性能评估

在3%纸浆浓度下，5%固定化酶用量能最大程度降解纤维素和半纤维素。随着纸浆浓度增加至10%，游离酶基本失效，而固定化酶仍表现出显著降解能力。 effluent分析显示，在3%纸浆浓度下，固定化酶处理组在465 nm（疏水性化合物）和237 nm（酚类化合物）处的吸光度值最高，表明其能有效释放墨水残留物。

实验方法

固定化酶通过将壳聚糖溶于0.1%乙酸，调节pH至5.5后，加入纯化酶和0.5%戊二醛交联6小时，再与PVA溶液混合制备而成。酶活性测定采用DNS法，在540 nm波长下检测还原糖含量。脱墨实验使用旧报纸和打印纸，在不同浓度（3%、5%、10%）下评估酶处理效果。

结论

Cs/PVA/Ga固定化纤维素酶体系展现出优异的操作稳定性和重复使用性，其适应更高温度和pH范围的特点使其更适合工业化应用。该技术为造纸工业提供了一种环境友好的脱墨方案，通过减少有毒废水排放和酶重复使用，显著提升了造纸过程的可持续性。未来研究应重点关注该技术的经济性评估和大规模应用潜力。