基于单细胞数字PCR技术的肝活检组织HBV DNA阳性细胞精准定量新方法及其临床转化意义

为解决慢性乙型肝炎(CHB)治疗中肝细胞内HBV DNA异质性检测难题，研究人员开发了单细胞感染检测PCR(scID-PCR)技术。该技术通过微滴封装单细胞并同步检测β-actin和cccDNA，实现了单细胞分辨率下HBV阳性细胞的精准定量。研究在细胞模型和临床肝活检样本中验证了方法的敏感性、特异性及重现性，成功检测到血清HBV DNA阴性患者的残留感染细胞，为CHB个体化治疗提供了新策略。

在全球范围内，乙型肝炎病毒（HBV）感染仍是严峻的公共卫生挑战。据世界卫生组织统计，2022年全球有2.54亿慢性乙型肝炎（CHB）患者，每年新增约120万感染病例，并导致约110万人死亡。中国作为HBV高负担国家，乙型肝炎表面抗原（HBsAg）携带率高达5-6%。HBV感染后，病毒在肝细胞内以共价闭合环状DNA（cccDNA）和整合型HBV的形式长期存在，这两种形式的持续存在是实现HBV完全治愈的主要障碍。因此，准确量化肝细胞内HBV DNA对于评估治疗效果和预测临床预后至关重要。

目前，临床上主要通过血清学标志物间接评估肝内HBV DNA水平，如血清HBV DNA、HBsAg、乙肝e抗原（HBeAg）和乙肝核心相关抗原（HBcrAg）。然而，即使血清HBV DNA低于检测限，肝细胞内仍可检测到cccDNA。此外，由于肝细胞内感染状态存在高度异质性，传统基于群体细胞的检测方法（如Southern Blot、qPCR和dPCR）取的是平均信号，无法反映细胞间的感染差异，尤其对于低病毒载量患者（如cccDNA<1拷贝/细胞）的检测灵敏度和准确性有限。因此，亟需开发能够在单细胞水平量化肝内HBV cccDNA的新方法，以深入解析感染的异质性。

针对这一需求，Li等人在《Journal of Translational Medicine》发表了题为“A single-cell digital PCR method tailored for quantification of HBV DNA positive cells in liver biopsy tissues”的研究论文，开发了一种名为单细胞感染检测PCR（scID-PCR）的新方法，专门用于肝活检样本中HBV DNA阳性（包括cccDNA和整合形式）细胞的检测和定量。

为开展本研究，作者主要应用了以下关键技术方法：利用肝活检组织酶解法制备单细胞悬液；通过DNase I消化和层流洗涤去除细胞外核酸以减少假阳性；优化微滴数字PCR（ddPCR）反应体系，包括引物/探针设计、增强剂使用和循环数调整；使用HepG2.2.15和Hep3B2.1-7细胞模型进行方法验证；采用RNAscope多重荧光和免疫荧光（IF）技术对比验证感染细胞比例；并纳入5例CHB患者和1例非HBV相关肝癌患者的临床样本进行概念验证。

Design of scID-PCR for quantifying intrahepatic HBV-positive cells

研究人员设计了scID-PCR工作流程，将单细胞封装入微滴中，通过在微滴内进行TaqMan PCR同时检测β-actin（细胞标识）和cccDNA。β-actin阳性（β-actin⁺）表明成功封装单细胞，而β-actin和cccDNA双阳性（β-actin⁺& cccDNA⁺）则表示HBV感染细胞。该方法不能区分整合型HBV DNA和cccDNA，因两者序列相同。通过泊松分布模型优化细胞与微滴比例，确定每20μL ddPCR反应体系中输入2,000-4,000个细胞可最大化检测信号并减少多细胞微滴。

Optimization of scID-PCR for the quantification of intrahepatic HBV-positive cells

通过优化引物探针（靶向rcDNA缺口区以特异性扩增cccDNA和整合DNA）、增加dNTPs和引物浓度、提高PCR循环数以及使用DNase I消化细胞外核酸，显著提高了信噪比和检测可靠性。所选引物探针适用于HBV基因型A-E。

Verification of scID-PCR using HBV cell models

在HepG2.2.15和Hep3B2.1-7细胞模型中，scID-PCR检测的HBV阳性细胞比例与RNAscope（靶向HBV基因组1244-1916区）和免疫荧光（抗HBcAg）结果高度一致，证实了其准确性。连续稀释实验显示HBV阳性细胞比例与预期稀释度呈良好线性关系。使用恩替卡韦（ETV）处理后，复制中间体（RIs）减少但不影响scID-PCR对感染细胞的检测可靠性，表明RIs的存在不干扰检测结果。

Detection of HBV-positive cells in liver biopsy tissues

在5例CHB患者和1例非HBV相关肝癌患者的肝活检样本中，scID-PCR在所有CHB患者中均检测到HBV阳性细胞，而在肝癌患者中未发现。治疗后48周，血清HBV DNA仍阳性的患者肝内HBV阳性细胞比例较高（CHB-1:35.81%；CHB-2:38.83%），而血清HBV DNA转阴者比例较低（CHB-3:19.29%；CHB-4:22.64%；CHB-5:12.88%）。肝内HBV阳性细胞比例与血清HBV DNA水平强相关（R²=0.899），与HBsAg弱相关（R²=0.372），与HBeAg无相关。根据血清标志物变化将患者分为三组，发现肝内感染细胞比例有助于区分治疗应答类型和预测预后。例如，低比例HBV阳性细胞（如CHB-5:12.88%）伴肝损伤（ALT/AST升高）提示感染细胞清除可能贡献肝炎症；高比例（>30%）即使血清学应答良好也可能需延长治疗。

本研究开发的scID-PCR方法首次实现了在单细胞分辨率下对肝内HBV阳性细胞的高通量、快速、精准定量，克服了传统批量检测方法的局限性。该方法在细胞模型和临床样本中表现出高灵敏度、特异性和重复性，能够检测到血清HBV DNA阴性患者的残留感染细胞，揭示了肝内感染的异质性。通过整合血清学标志物和肝内感染细胞比例，scID-PCR为CHB患者的个体化治疗提供了更全面的评估工具，有助于区分治疗应答类型、指导治疗策略和预测临床结局。此外，该方法具有拓展应用于其他潜伏或低丰度病原体（如HSV、VZV、EBV、CMV等）检测的潜力。尽管存在无法精确量化细胞内HBV DNA拷贝数及依赖肝活检样本的限制，scID-PCR仍代表了HBV检测技术的重要进步，对推动HBV治愈研究具有重要科学和临床意义。