‘Candidatus Phytoplasma solani’不同tuf型菌株的致病性差异及其在番茄中的全方面表征：从侵染机制到分子互作研究

本研究系统揭示了‘Candidatus Phytoplasma solani’不同tuf基因型菌株（tuf-a/tuf-b1）在番茄中的致病性分化，通过多基因位点序列分型（MLST）和超微结构分析，首次明确了菌株基因型与症状表现、体内扩散动态及寄主互作模式的关联性，为植物病原体-寄主协同进化研究提供了关键模型。

　　

1 引言

‘Candidatus Phytoplasma solani’（‘Ca. P. solani’）是欧洲-地中海地区葡萄金黄化病（Bois noir, BN）和茄科植物Stolbur病的主要病原体，其主要传播媒介为Hyalesthes obsoletus Signoret。该病原体存在显著遗传多样性，其中tuf基因（延伸因子热不稳定基因）分型是区分其生态病理系统的关键标志：tuf-a型与刺荨麻（Urtica dioica）-H. obsoletus-葡萄路径相关，而tuf-b1型与田旋花（Convolvulus arvensis）-H. obsoletus-葡萄路径相关。本研究以番茄栽培种Micro-Tom为模型植物，通过媒介昆虫接种和嫁接传毒，系统研究不同tuf型菌株的致病机制、分子特征及与寄主的互作模式。

2 材料与方法

2.1 菌株传毒与症状监测

在意大利弗留利-威尼斯朱利亚（FVG）地区BN高发葡萄园中，通过网捕法采集刺荨麻和田旋花上的H. obsoletus成虫，分别强迫饲毒于健康番茄植株。同时放置番茄诱饵植物于田间4周，自然获毒。所有植株在可控温室条件下培养，定期观察症状发展，并通过实时荧光定量PCR（qPCR）与高分辨率熔解曲线（HRM）分析确认感染。

2.2 多位点序列分型（MLST）分析

对所有菌株进行四个基因（tuf、secY、stamp、vmp1）的PCR扩增、测序和限制性片段长度多态性（RFLP）分析。系统发育树通过邻接法（Neighbor-Joining）构建，采用MEGA7软件完成1000次 bootstrap 验证。

2.3 病原种群动态定量

选择代表性菌株（C2、C4、U3、Sol），在接种后20、29、37天分别取样植株顶端、下部叶片和根部，通过qPCR定量分析病原体浓度（基因组单位/植物基因组DNA纳克数），并使用三因素方差分析（three-way ANOVA）统计不同菌株、部位和时间点的差异。

2.4 透射电子显微镜（TEM）分析

取接种55天后的番茄叶中脉样本，经醛酸固定、锇酸后固定、树脂包埋和超薄切片后，在PHILIPS CM 10透射电镜下观察韧皮部超微结构变化。

3 结果

3.1 症状表现与菌株关联性

tuf-b1型菌株（源自田旋花路径）感染番茄后典型症状包括：花器畸形（花椰菜状花序、巨人蕾、绿变症）和叶片迷你化、 chlorosis（褪绿），植株可存活超过4个月并产生大量侧枝。tuf-a型菌株（源自刺荨麻路径）则引起叶柄坏死、花器脱落，植株在95–100天后迅速衰退死亡。所有菌株均引起叶片 chlorosis 和 miniaturization，但花器症状和病程结局具有基因型特异性。

3.2 分子分型与系统发育

基于tuf、secY、stamp、vmp1基因的MLST分析将菌株划分为5个进化谱系，归属于3个主要簇：tuf-a型聚集为一簇（刺荨麻相关），tuf-b1型分为两簇（田旋花相关）。RFLP和序列分析进一步揭示了vmp1和stamp基因的高变异性，其中vmP1-RFLP鉴定出6种酶切谱型，与菌株生态起源高度相关。

3.3 病原动态与侵染模式

q定量PCR显示，tuf-a型菌株（如U3）早期（20 dpi）在植株下部浓度较低，但后期增殖加速；tuf-b1型菌株（如C4）则在整个病程中维持较高浓度。根部病原载量普遍高于叶部，且菌株-部位-时间三者交互作用显著（p < 0.05）。表明tuf-a型菌株虽初始定殖慢，但后期更具侵袭性。

3.4 超微结构病理变化

TEM观察发现，tuf-a型菌株感染后筛分子内出现大量胼胝质沉积和筛板堵塞，病原体聚集成暗色团块，阻碍韧皮部运输；而tuf-b1型菌株感染样本中仅部分筛分子发生变形，胼?质积累较少。所有感染植株均出现细胞壁增厚现象，与病原负荷和症状严重度正相关。

4 讨论

本研究首次系统证实‘Ca. P. solani’不同tuf基因型菌株在番茄中表现出截然不同的致病模式：tuf-b1型倾向于引起典型Stolbur症状（花器变态），而tuf-a型则导致快速衰退和坏死症状。这种差异与病原体效应蛋白（如SAP11-like和SAP54-like）的基因组多样性相关，可能影响寄主防御响应和形态建成通路。电镜结果进一步从细胞水平揭示了胼胝质过度积累与病害进展的直接关联。

该研究为理解植物菌原体致病性分化提供了分子与病理学证据，强调了生态起源-基因型-表型之间的内在联系。未来研究应聚焦于效应蛋白功能分析及菌株在葡萄等经济作物中的侵袭性差异，为病害生态防控提供理论依据。