两性离子聚合物化合物（CPLL/DMGA-PLL）作为新型冷冻保护剂提升猪体外受精原核期及囊胚玻璃化冷冻效果的研究

本刊推荐：本研究首次系统评估了两种两性离子聚合物化合物——羧化聚赖氨酸（CPLL）和3,3-二甲基戊二酸酐聚赖氨酸（DMGA-PLL）作为冷冻保护剂（CPA），在猪体外受精（IVF）来源的原核期胚胎及囊胚玻璃化冷冻（Cryotop法）中的应用。结果表明，10% DMGA-PLL能显著提升囊胚存活率及原核期胚胎的体外发育潜能（囊胚形成率与未冷冻组无显著差异），为猪胚胎冷冻保存及遗传资源库建立提供了创新性技术方案。

　　

1 引言

猪胚胎的长期冷冻保存对于优良畜牧遗传资源的保存与低成本运输具有重要意义，但由于猪卵母细胞和胚胎胞质内脂质含量显著高于其他哺乳动物，使其对低温损伤极为敏感。早期胚胎中丰富的大型脂滴随着发育至囊胚阶段逐渐减少，使得囊胚对冷冻的耐受性增强。然而，目前猪囊胚冷冻存活率在不同实验室间存在差异，尚未建立如牛胚胎冷冻那样成熟的技术体系。此外，猪因与人类解剖和生理特征相似，已成为生物医学研究中重要的基因修饰模型动物。通过向原核期胚胎注射外源DNA或CRISPR/Cas9基因组编辑组件，可制备转基因或基因敲除猪模型。屠宰场来源的卵母细胞经体外受精可获得大量原核期胚胎，其冷冻保存为基因修饰模型制备提供了材料基础。虽然通过离心和显微操作物理去除脂质可提升早期猪胚胎冷冻存活率并成功产仔，但该方法耗时费力，开发非侵入性简易冷冻方法迫在眉睫。

当前，玻璃化冷冻是猪胚胎冷冻保存的常用方法，而冷冻保护剂是成败的关键因素。尽管二甲基亚砜、乙二醇、甘油和聚乙二醇等CPA广泛用于哺乳动物卵母细胞和胚胎冷冻，但猪胚胎可能需要新型高效CPA。羧化聚赖氨酸（CPLL）作为一种通过ε-聚赖氨酸与琥珀酸酐合成、将65 mol%氨基转化为羧基的两性离子聚合物化合物，已被证明可有效用于猪原核期胚胎玻璃化冷冻。近期研究进一步显示，CPLL在猪精子冷冻保存中具有应用价值，而新型化合物3,3-二甲基戊二酸酐聚赖氨酸（DMGA-PLL）效果更优。本研究旨在系统评估CPLL和DMGA-PLL作为CPA对猪原核期和囊胚期胚胎玻璃化冷冻的效果。

2 材料与方法

2.1 伦理声明

本研究使用商业设施提供的猪卵巢和精液，未使用活体动物，无需伦理审批。

2.2 卵母细胞体外受精

从当地屠宰场青春期前小母猪卵巢（卵泡直径2–6 mm）中采集卵丘-卵母细胞复合体，选择具有致密卵丘细胞团和均匀胞质的复合体，每组40–50个移入含200 μL成熟培养液的35 mm聚苯乙烯培养皿中，覆盖石蜡油，在38.5°C、5% CO₂条件下培养36–38 h。成熟培养液以90% TCM-199为基础，添加0.91 mM丙酮酸钠、3.05 mM D-葡萄糖、0.57 mM半胱氨酸盐酸盐、10 ng/mL表皮生长因子、10 IU/mL eCG、10 IU/mL hCG、100 μg/mL硫酸阿米卡星、0.1%聚乙烯醇和10%猪卵泡液。体外成熟后，通过涡旋振荡在含0.1%透明质酸酶的HEPES-TLP-PVA液中去除卵丘细胞，将裸露卵母细胞每组15–20个移入80 μL受精液滴中。受精液包含114.0 mM NaCl、3.2 mM KCl、6.76 mM CaCl₂·2H₂O、0.5 mM MgCl₂·6H₂O、0.1 mM丙酮酸钠、10.0 mM乳酸钠、0.35 mM NaH₂PO₄·2H₂O、5.0 mM D-葡萄糖、25.0 mM NaHCO₃、0.3%牛血清 albumin、100 μg/mL硫酸阿米卡星和2.0 mM咖啡因。冷冻精液解冻后以3.5×10⁷精子/mL浓度悬浮于受精液，将20 μL精子悬液引入含卵母细胞的80 μL液滴，最终精子浓度为7.0×10⁶/mL，在38.5°C、5% CO₂条件下共培养12 h。

2.3 原核期及囊胚期胚胎制备

精卵共培养后，部分卵母细胞转移至1 mL HEPES-TLP-PVA液中，经9730×g离心10 min（37°C）以显影原核。具有两个原核的卵母细胞定义为原核期胚胎，用于玻璃化冷冻。其余卵母细胞移入50 μL改良PZM-3（mPZM-3）液滴，在38.5°C、5% CO₂、5% O₂、90% N₂条件下培养6天，选择直径与卵母细胞相似或更大的囊胚和扩张囊胚用于冷冻。

2.4 平衡、玻璃化及复苏溶液配制

以含20 mM HEPES的改良PZM-3（替代0.3% BSA）为基础液。平衡液1由基础液添加20%胎牛血清和10%乙二醇配制；平衡液2添加20% FBS、10%乙二醇、1%聚乙二醇和0.3 M无水海藻糖。玻璃化溶液添加20% FBS、33%乙二醇、2%聚乙二醇和0.6 M无水海藻糖。复苏液添加20% FBS、10%乙二醇和0.3 M无水海藻糖。CPLL和DMGA-PLL按不同浓度添加至玻璃化溶液，平衡液1和2中分别添加玻璃化溶液四分之一和二分之一的聚合物浓度。

2.5 胚胎玻璃化冷冻与复苏

将原核期胚胎、囊胚或扩张囊胚以每组10–20个（原核期）或3–14个（囊胚/扩张囊胚）依次在平衡液中各平衡5 min。平衡后胚胎移入玻璃化溶液，置于Cryotop顶端，1 min内投入液氮。平衡和玻璃化溶液均在38.5°C使用。冷冻胚胎在液氮中保存至少3天。复苏时，将载有胚胎的Cryotop从液氮中取出，顶端直接浸入40°C复苏液，脱落的胚胎在同一溶液中38.5°C平衡3 min，随后转移至mPZM-3（原核期胚胎）或含10% FBS的mPZM-3（囊胚/扩张囊胚）中再平衡3 min。

2.6 冷冻复苏胚胎存活与发育评估

复苏后，原核期胚胎移入新鲜mPZM-3液滴，在38.5°C、5% CO₂、5% O₂、90% N₂条件下培养。复苏1 h后评估存活，形态正常、无裂解、萎缩、肿胀或变暗的胚胎视为存活。存活胚胎继续培养，分别于第2天和第7天统计卵裂率和囊胚形成率。培养结束时，通过Hoechst 33342染色计数囊胚细胞数。囊胚和扩张囊胚移入新鲜mPZM-3-FBS液滴培养，复苏后24 h和48 h观察，重新形成囊胚腔的胚胎视为存活。

2.7 实验设计

实验1：囊胚和扩张囊胚在含0%、5%、10%或15% CPLL的玻璃化溶液中冷冻，评估CPLL浓度对冷冻耐受性的影响。

实验2：囊胚在含0%、5%、10%、15% DMGA-PLL的溶液中冷冻，评估DMGA-PLL的影响。

实验3：比较10% CPLL与10% DMGA-PLL对囊胚/扩张囊胚冷冻保护效果，设无添加对照组。

实验4：原核期胚胎在含0%、10%、20% CPLL的溶液中冷冻，评估CPLL浓度影响。

实验5：原核期胚胎在含0%、10%、20% DMGA-PLL的溶液中冷冻，评估DMGA-PLL浓度影响。

实验6：比较10% CPLL与10% DMGA-PLL对原核期胚胎冷冻保护效果，设无添加对照组。

实验7：评估含/不含10% DMGA-PLL冷冻对原核期胚胎体外发育的影响，设未冷冻对照组。

2.8 统计分析

采用双因素方差分析（实验1–3）或单因素方差分析结合Fisher保护最小显著差法（实验4–7）处理数据。百分比数据经反正弦转换后分析，p<0.05认为差异显著。

3 结果

3.1 实验1：不同浓度CPLL冷冻囊胚与扩张囊胚的存活率

扩张囊胚复苏后24 h（p<0.01）和48 h（p<0.05）存活率显著高于未扩张囊胚。不同CPLL浓度对囊胚和扩张囊胚24 h（p<0.01）和48 h（p<0.05）存活率有显著影响。24 h时，胚胎阶段与CPLL浓度对存活率存在交互作用（p<0.01）。10% CPLL组存活率最高（囊胚39.1%，扩张囊胚70.0%），15% CPLL组存活率下降。

3.2 实验2：不同浓度DMGA-PLL冷冻囊胚与扩张囊胚的存活率

囊胚与扩张囊胚在24 h和48 h存活率无显著差异。DMGA-PLL浓度对24 h存活率无影响，但48 h存活率有显著差异（p<0.01），10% DMGA-PLL组存活率最高（囊胚36.8%，扩张囊胚53.2%），15%组存活率降低。

3.3 实验3：CPLL与DMGA-PLL对囊胚/扩张囊胚冷冻保护效果比较

扩张囊胚48 h存活率显著高于囊胚（p<0.05）。不同添加物对24 h和48 h存活率有显著影响（p<0.01），10% DMGA-PLL组存活率最高（囊胚54.5%，扩张囊胚58.9%）。48 h时胚胎阶段与添加物存在交互作用（p<0.05）。

3.4 实验4：不同浓度CPLL冷冻原核期胚胎的存活与发育

CPLL浓度（10%–20%）对胚胎存活率（79.9%–87.5%）无显著影响，但20% CPLL组卵裂率（48.0%）显著低于10%组（67.7%，p<0.01）。囊胚形成率（18.5%–35.3%）无显著差异，但10% CPLL组（35.3%）有高于0%或20%组（18.5%–20.8%）的趋势（p=0.052）。囊胚细胞数（35.4–41.7）无组间差异。

3.5 实验5：不同浓度DMGA-PLL冷冻原核期胚胎的存活与发育

DMGA-PLL浓度对存活率（78.1%–89.8%）无影响。10% DMGA-PLL组卵裂率（66.5%）显著高于0%组（42.4%，p<0.05）；囊胚形成率（36.8%）显著高于0%组（11.1%，p<0.01）和20%组（19.9%，p<0.05）。囊胚细胞数（38.7–45.8）无显著差异。

3.6 实验6：CPLL与DMGA-PLL对原核期胚胎冷冻保护效果比较

10% CPLL或DMGA-PLL对存活率（81.8%–85.7%）无影响，但两者卵裂率（68.3%、72.8%）显著高于无添加组（51.2%）；囊胚形成率（36.4%、45.7%）显著高于无添加组（14.1%，p<0.01）。囊胚细胞数（38.2–44.2）无组间差异。

3.7 实验7：DMGA-PLL冷冻对原核期胚胎体外发育的影响

含/不含DMGA-PLL冷冻组卵裂率（54.5%、69.6%）均显著低于未冷冻组（77.4%）。无DMGA-PLL冷冻组囊胚形成率（16.7%）显著低于未冷冻组（37.4%，p<0.01），而含10% DMGA-PLL冷冻组（35.1%）与未冷冻组无显著差异。囊胚细胞数（38.2–43.1）无组间差异。

4 讨论

本研究首次证实两性离子聚合物化合物CPLL和DMGA-PLL作为CPA可提升猪原核期和囊胚期胚胎玻璃化冷冻效果，其中DMGA-PLL效果优于CPLL，10%为最佳浓度。CPLL通过强分子间作用促进玻璃化转变，捕获水和盐离子，抑制冷冻过程中冰晶形成和渗透损伤。DMGA-PLL可能具有类似机制，其在人骨髓间充质干细胞冷冻中已显示抑制结晶的能力。本研究与猪精子冷冻研究结果一致，DMGA-PLL在冷冻延伸剂中能提升精子运动力和胚胎发育能力，且人工授精后产仔数无显著差异。

胚胎阶段对冷冻耐受性有重要影响，扩张囊胚因脂质进一步减少，通常比未扩张囊胚存活率更高。本研究中实验1和3结果符合这一规律，而实验2未显示差异，可能与实验季节有关：实验2在春季进行，卵母细胞发育潜能较高，提升了囊胚存活率。

尽管未进行体内发育验证，但原核期胚胎经10% DMGA-PLL冷冻后囊胚形成率与未冷冻组相当，提示其具备发育为仔猪的潜力。本研究建立的DMGA-PLL玻璃化冷冻协议为猪遗传资源保存、基因修饰模型制备及非手术胚胎移植提供了可靠技术支撑，有望在畜牧业和生物医学领域推广应用。