RNA降解组学与蛋白质组学揭示dsProsβ1介导的蛋白酶体靶向机制在小油菜跳甲中的杀虫作用

本研究通过整合RNA降解组学（RNA degradomics）、RISC结合小RNA测序（RISC-bound sRNA-seq）和蛋白质组学（proteomics）技术，系统阐明了靶向蛋白酶体亚基β1（proteasome subunit beta type-1, Prosβ1）的双链RNA（dsProsβ1）在重要农业害虫小油菜跳甲（Psylliodes chrysocephala）中的分子作用机制（Mode-of-Action, MoA）。研究发现dsProsβ1可被加工成21 nt的小干扰RNA（siRNA）并引导RNA诱导沉默复合体（RISC）特异性切割靶标mRNA，其中切割效率与siRNA序列特征密切相关。蛋白质组分析显示蛋白酶体功能抑制导致线粒体和细胞骨架相关蛋白积累，而转录翻译相关蛋白显著减少，揭示了其通过破坏蛋白质稳态和氨基酸回收途径导致害虫死亡的深层机理。该研究为优化RNA干扰（RNAi）害虫防控策略提供了重要分子见解。

　　

1 引言

小油菜跳甲（CSFB）是冬季油菜作物的主要害虫，尤其在北欧地区造成严重危害。随着新烟碱类杀虫剂的禁用和拟除虫菊酯抗性种群的出现，其防治变得日益困难。RNA干扰（RNAi）技术因其环境友好特性被视为有潜力的替代策略，其中蛋白酶体亚基被证实是高效的RNAi靶标。尽管靶向蛋白酶体亚基β5（proteasome subunit beta type-5）的dsRNA喷雾剂已成功用于防治科罗拉多马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineata），但蛋白酶体靶向型杀虫dsRNA的分子作用机制（MoA）尚未完全阐明。本研究以CSFB为模型，通过多组学联用策略深入解析dsProsβ1的杀虫机制。

2 方法

2.1 昆虫培养与生物信息学分析

实验室种群的小油菜跳甲在21±1°C、65±10%相对湿度和16小时光照/8小时黑暗循环条件下饲养。通过转录组数据获取Pc-prosβ1序列，利用AlphaFold 3预测其三维结构，并通过系统发育分析验证其保守性。

2.2 dsRNA合成与饲喂

设计长度为396 bp的dsProsβ1靶向Pc-prosβ1开放阅读框（ORF）区域（353-749 nt），并以dsmGFP作为对照dsRNA。将500 ng dsRNA溶液均匀涂抹于油菜叶片背面，饲喂新羽化的雌性成虫。

2.3 RNA降解组测序与RISC结合小RNA测序

分别于处理后3天采集昆虫样本，通过RNA降解组测序识别siRNA介导的切割位点，并通过RISC结合小RNA测序分析成熟的siRNA。使用CleaveLand4软件进行切割事件分析，并整合两组数据评估siRNA丰度与切割效率的相关性。

2.4 蛋白质组学分析

处理后5天采集样本，通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术进行蛋白质组定量分析，筛选差异表达蛋白并进行基因本体（GO）富集分析。

3 结果

3.1 Pc-prosβ1的生物信息学特征

Pc-prosβ1编码234个氨基酸，具有典型的球形折叠结构，其蛋白序列在鞘翅目害虫中高度保守。系统发育分析显示其与赤拟谷盗（Tribolium castaneum）等物种的Prosβ1直系同源蛋白聚类。

3.2 RNA降解组识别dsProsβ1诱导的切割事件

在dsProsβ1处理组中，靶标转录本（Pc-prosβ1）的dsRNA互补区域内检测到多个切割位点，主要切割事件位于转录本520 nt位置（对应dsProsβ1的167 bp处）。切割位点分析显示，反义siRNA第10-11位核苷酸对为尿嘧啶-鸟嘌呤（UG）和腺嘌呤-腺嘌呤（AA）时切割频率较高，而鸟嘌呤-胞嘧啶（GC）对则呈现低切割效率。

3.3 RISC结合小RNA测序鉴定成熟siRNA

dsProsβ1被加工成21 nt长度的siRNA，其在RISC中的反义链在首位偏好腺嘌呤（A），第3位偏好尿嘧啶（U）。测序数据未发现次级siRNA生成，表明dsProsβ1的作用具有高度特异性。

3.4 多组学数据整合

siRNA丰度与切割频率呈弱正相关（r=0.224, P=0.018），但部分高丰度siRNA对应的切割事件较少，表明siRNA的切割效率还受其生化特性（如GC含量、热力学稳定性）影响。

3.5 蛋白质组揭示dsProsβ1对蛋白水平的影响

dsProsβ1处理导致326个蛋白表达量发生变化，其中221个蛋白表达下调，105个上调。GO分析显示线粒体相关蛋白（如能量代谢蛋白）和细胞骨架蛋白（如肌动蛋白结合蛋白）表达升高，而核糖体蛋白、mRNA结合蛋白等翻译相关蛋白显著减少。未折叠蛋白结合功能也受到抑制，表明蛋白酶体功能受阻引发负反馈调节。

4 讨论

本研究通过多组学联用揭示了dsProsβ1的分子作用机制：dsRNA被加工成siRNA后引导RISC切割靶标mRNA，其切割效率与siRNA序列特征密切相关。蛋白酶体功能抑制导致高周转率蛋白（如细胞骨架蛋白）积累，而氨基酸回收受阻引发翻译相关蛋白下调，最终通过破坏蛋白质稳态导致害虫死亡。研究还发现，优化dsRNA设计时应兼顾siRNA加工效率与切割活性，例如优先选择富含AU的序列区域以提升杀虫效果。

5 结论

RNA降解组学、RISC结合小RNA测序和蛋白质组学的结合为解析RNAi杀虫机制的分子细节提供了强大工具。研究结果不仅阐明了蛋白酶体靶向dsRNA的作用原理，也为设计高效、特异的RNAi害虫防控策略提供了理论依据。