基于蛋白表达模式的细胞术数据稳健双联体检测工具Cleanet的开发与应用

本文综述了Cleanet这一创新性算法在流式与质谱细胞术数据中实现双联体（doublet）自动检测的原理与效能。该方法突破传统二维设门的局限，利用多维度蛋白表达模式（如CD45、DNA intercalator等标志物），通过模拟双联体生成与近邻分类策略，显著提升对同型（homotypic）与异型（heterotypic）双联体的识别准确性，并经成像细胞术（ImageStream、Discover A8）验证，为大规模免疫细胞研究（如细胞互作、肿瘤微环境分析）提供可靠的数据清洗方案。

　　

2.1 方法概述

Cleanet通过模拟双联体事件并分析其蛋白表达模式实现检测。其核心步骤包括：从原始数据中随机抽样N/2对细胞事件，将每对细胞的蛋白表达值相加生成模拟双联体；将模拟双联体与原始数据合并形成增强数据集，经双曲正弦变换（arcsinh transform，默认质谱细胞术cofactor=5，流式细胞术cofactor=500）后，使用分层可导航小世界算法（Hierarchical Navigable Small Worlds）计算近邻；若某原始事件的15个最近邻中有超过5个为模拟双联体，则判定其为真实双联体。

与单细胞转录组双联体检测工具DoubletFinder（采用表达值取平均的策略）不同，Cleanet假设细胞术抗体探针饱和靶蛋白，因此双联体的信号强度应为组成细胞之和（图1C）。这一模型更符合细胞术数据特性，且能有效识别同型双联体（传统方法难以区分）。Cleanet还提供内部置信度指标，即模拟双联体中被正确分类的比例，用于评估算法适用性。

2.2 质谱细胞术数据验证与细胞比例稳定性提升

在包含169个全血样本的质谱细胞术数据中，Cleanet与人工设门结果高度一致。传统方法依赖DNA intercalator（如¹⁹¹Ir、¹⁹³Ir）通道的二维密度图识别双联体，但存在局限性：例如嗜酸性粒细胞（eosinophil）因高DNA含量易被误判为双联体（图2A）。Cleanet通过多维度蛋白表达（如CD45、CD66b、CD294）分析，更准确地将这些事件判定为单细胞（图2B,D）。

在19个技术重复样本中，Cleanet去除双联体后嗜酸性粒细胞比例变异系数（CV）显著降低（图2C），证明其能减少技术误差带来的变异。算法在低事件数（≥500）或少标志物（≥6个）条件下仍保持稳健（灵敏度>70%，特异性>90%），且无需DNA intercalator通道亦可运行（图2E）。实验还显示，当样本中碎片（debris）比例超过20%时，Cleanet性能下降，但预处理去除碎片后可恢复准确性（图2F）。

2.3 流式细胞术数据应用与双联体组成分类

在16色流式细胞术PBMC数据中，Cleanet仅使用荧光通道（如CD3、CD14），与基于散射光（FSC-A/FSC-H）的自动化工具PeacoQC结果高度一致（图3A）。随标志物数量减少，性能逐步下降，但降解趋势平缓（图3B），表明多标志物共同提供冗余信息。

Cleanet可进一步扩展至双联体组成分类：若用户提供单细胞的细胞类型标签（如通过FastPhenograph聚类），算法可判定双联体为同型（如T细胞-T细胞）或异型（如单核细胞-T细胞）。观察到的双联体类型频率与基于细胞丰度的期望频率高度相关（图3C），且真实双联体与模拟双联体的蛋白表达分布高度相似（图3D），验证了模拟机制的可靠性。

2.4 成像细胞术验证与相互作用检测

使用ImageStream数据（含Raji和THP1细胞系混合样本），Cleanet基于5个荧光通道（CellTrace黄/紫、亮场、活性染料）检测双联体，结果与形态学通道的人工设门相近（图4A,B）。经Rituximab处理后，抗CD20抗体介导细胞相互作用，Cleanet检测到Raji-THP1异型双联体比例显著高于预期（图4D），证明其能捕捉生物学互作。

以人工标注图像为金标准，Cleanet的受试者工作特征曲线下面积（ROC AUC）与人工设门方法相当（图4E,F）。在争议事件中（如Cleanet判为双联体而设门判为单细胞），图像显示部分事件实含多个细胞碎片（图4G），提示Cleanet可能捕获了传统方法遗漏的复杂事件。

2.5 光谱成像细胞术数据评估

在FACSDiscover A8采集的骨髓（AML患者）和外周血样本中，Cleanet使用26个荧光通道检测双联体，其预测结果在散射光（FSC-A/FSC-H）和成像通道（偏心率、径向矩）二维图上均与传统双联体分布区域重叠（图5A,B）。以图像标注为基准，成像通道设门（径向矩阈值）性能最优（AUC≈0.99），但Cleanet与PeacoQC（AUC≈0.85–0.95）表现接近（图5C,D），且在复杂样本（骨髓）中仍保持稳定。

3 方法细节

数据预处理包括碎片去除（质谱细胞术基于蛋白表达距离阈值，流式细胞术基于FSC-A+SSC-A总和）。Cleanet核心参数（近邻数、判定阈值）可调，以适配不同数据特性。算法独立应用于每个文件，避免样本间批次效应影响。

4 讨论

Cleanet是首款基于多维度蛋白表达的细胞术双联体检测方法，兼顾自动化与鲁棒性，尤其适用于标志物信号质量不均或传统通道（DNA intercalator、散射光）表现不佳的场景。其双联体分类功能为研究细胞互作（如免疫突触、吞噬作用）提供新思路。局限包括对高碎片样本敏感、计算耗时较长，但预处理和硬件优化可缓解。Cleanet有望推动大规模细胞术数据分析的标准化与可扩展性。