响应面法优化家蝇幼虫酶解肽的提取工艺及抗氧化活性评价

本刊推荐：本研究采用响应面法（RSM）优化家蝇（Musca domestica）幼虫酶解工艺，确定中性蛋白酶为最佳用酶，在时间3.2 h、温度43.0°C、酶添加量5300.0 U/g、pH 6.4条件下，肽的DPPH自由基清除率达70.9%。研究通过紫外-可见（UV）光谱、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、X射线衍射（XRD）和扫描电子显微镜（SEM）等手段系统表征了肽的理化特性，发现分子量小于10 kDa的肽段（MDPs

　　

1 引言

随着现代生活节奏加快，人类暴露于不良生活习惯、不健康饮食及高压力水平等多种有害刺激中，导致体内自由基（活性氧，ROS）过量产生。过量的自由基积累会引发氧化应激，破坏机体自然平衡并削弱其防御机制。氧化应激通过损害细胞膜、脂质、蛋白质甚至DNA，加速衰老并促进慢性疾病（如糖尿病、癌症、心血管疾病、阿尔茨海默病及神经退行性疾病）的发生发展。值得注意的是，DPPH（2,2-二苯基-1-苦基肼）自由基作为一种重要且普遍存在的自由基，对人类细胞具有不利影响。此外，食品中使用的合成抗氧化剂可能存在潜在健康风险。因此，开发安全、高效且生物相容性好的天然抗氧化剂以替代或补充合成抗氧化剂显得尤为迫切。近年来，从动物、植物及昆虫等天然来源获取抗氧化肽的研究日益广泛。昆虫因其高蛋白含量而成为生产抗氧化肽的潜在蛋白质资源。

昆虫来源的抗氧化肽因其高活性、安全性、吸收效率高及低过敏性而受到越来越多的关注。家蝇（Musca domestica）幼虫富含蛋白质，干重中蛋白质含量占58.8%至63.9%。在传统中药中，家蝇幼虫被称为“五谷虫”，几个世纪以来一直被用于治疗小儿营养不良。令人惊讶的是，尽管家蝇肽（MDPs）是家蝇的主要活性成分，但过去十年中对MDPs的研究仍然有限。酶解法制备抗氧化肽具有反应条件温和、可控性强、重复性好及选择性高等优点，是制备生物活性肽最常用的方法。尽管已有少量研究探讨了双频超声参数（如超声时间、功率和频率）对酶解过程中MDPs抗氧化活性的影响，但酶解条件对其抗氧化活性的具体影响尚不清楚。更重要的是，尚未有关于酶种类对MDPs抗氧化活性影响的研究报道。

本研究旨在通过响应面法（RSM）结合Box-Behnken设计（BBD）确定获得MDPs的最佳酶解参数（包括时间、温度、酶添加量和pH）。BBD相较于其他实验设计能更好地拟合二次模型，并具有成本低、效率高的优势。优化后，采用超滤法纯化粗MDPs，并利用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、扫描电子显微镜（SEM）、X射线衍射（XRD）和紫外-可见（UV）光谱等多种先进分析技术全面表征MDPs的结构特性。此外，还详细比较分析了总MDPs、分子量大于10 kDa的肽段（MDPs_>?10?kDa）和分子量小于10 kDa的肽段（MDPs_{）之间的差异。同时，通过DPPH自由基清除实验、羟基自由基清除实验和还原力实验评估了MDPs的体外抗氧化活性。这项开创性研究首次报道了家蝇幼虫MDPs的最佳酶解条件，是该研究领域的重大进展。}

2 材料与方法

2.1 材料

实验所用的家蝇幼虫购自ChanBao生物技术有限公司（鹤岗，中国）。胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶和风味蛋白酶购自北京博奥拓达科技有限公司（北京，中国）。氨基酸标准和DPPH购自Sigma-Aldrich公司（美国密苏里州圣路易斯）。离心过滤装置（88513）由Thermo Fisher Scientific公司（美国沃尔瑟姆）提供。所有其他试剂均为色谱级或分析纯。

2.2 MDPs的制备

幼虫处理方法参照Miao等人的方法。简要步骤如下：幼虫用去离子水清洗，并在-30°C下冷冻干燥。干燥后的幼虫用粉碎机（FW177，天津，中国）研磨成细颗粒，过40目筛。所得粉末用石油醚脱脂，得到脱脂家蝇幼虫粉。为提取粗蛋白，将脱脂粉与碱性水在烧杯中混合，温和煮沸2.5小时。然后使用离心机（H2050R，湘仪有限公司，长沙，中国）在10°C下以3000× g离心15分钟。收集上清液并保存于-80°C备用。

酶解过程：取10.0 g家蝇幼虫蛋白粉，在控制条件下进行水解：水解时间（X₁, 1.0–5.0 h）、温度（X₂, 25.0°C–65.0°C）、酶添加量（X₃, 3000–7000 U/g）和pH（X₄, 5.0–9.0）。水解结束后，在100°C加热10分钟使酶失活。溶液中和后，以4000× g离心10分钟。收集上清液，通过超滤膜（88,513，Spectrum Medical Industries Inc.，美国洛杉矶）过滤，得到两个组分：MDPs_>?10?kDa和MDPs_{。组分使用冷冻干燥机（LGJ-18 N，雅兴益科有限公司，北京，中国）进行冻干。对粗MDPs进行表征并储存以备进一步分析。}

2.3 适宜蛋白酶的确定

取六份家蝇幼虫蛋白粉，每份8.0 g，分别与120 mL去离子水充分混合。将每份溶液的pH调整至各自的最佳水平。然后分别向每份中加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶和风味蛋白酶，添加量为3000 U/g。第七份作为对照，不添加任何蛋白酶。酶解反应在37°C恒温下进行4小时，并持续振荡。通过将混合物加热至100°C保持10分钟来终止反应。水解液经0.22 μm膜过滤器过滤。收集滤液，冻干，并储存于-80°C备用。

2.4 RSM实验设计

根据BBD，设计了广泛的RSM研究。采用三水平（-1, 0, +1）设计来确定MDPs的最佳酶解条件。该设计涉及使用具有四个独立变量、每个变量三个水平的BBD，生成了二阶多项式回归模型。基于单因素试验结果的分析，选择了独立变量：水解时间（X₁）、温度（X₂）、酶添加量（X₃）和pH（X₄）。随后，研究了这些变量的最佳范围，并确定适用于后续测试。整体设计包括29个实验运行，其中特意在中心点设置了五个重复。为确保模型的有效性和稳健性，每个组合进行三次重复测试。

2.5 MDPs的表征

2.5.1 UV光谱及内源荧光分析

首先，将10.0 mg各MDPs样品溶解于5.0 mL去离子水中。然后使用U-2901紫外-可见分光光度计（日立有限公司，日本东京）测量每个样品在200至800 nm范围内的最大吸收波长。使用OriginPro 9.0软件捕获和分析所得UV光谱。

为深入研究MDPs的内源荧光特性，在去离子水中制备浓度为1.0 mg/mL、pH为7.0的溶液。使用F-7100荧光分光光度计（日立有限公司，日本东京）分析该溶液。实验参数设置如下：激发波长280 nm，扫描速度5 nm/s，发射光谱范围300至450 nm，扫描速度相同。激发和发射的狭缝宽度固定为5 nm，以确保实验精度。

2.5.2 粒径分布及Zeta电位

将MDPs溶液用去离子水稀释至浓度为1.0 mg/mL，每个稀释后的样品转移至单独的比色皿中。使用激光衍射粒度分析仪（NanoBrook 90Plus，Brookhaven Instruments Corp.，美国纽约）分析粒径分布和Zeta电位。所有测量均在25°C恒温下进行。为确保准确性和可重复性，每个样品测试三次。

2.5.3 FT-IR光谱

使用FT-IR光谱仪（Nicolet NEXUS 470，Thermo Fisher Scientific，美国）记录MDPs的红外光谱。样品制备方法：将10.0 mg干燥的MDPs与100.0 mg KBr均质化成细粉。然后将混合物压制成直径为1 mm的片剂。在室温下，以透射模式在4000至400 cm^?1的波数范围内采集光谱。

2.5.4 XRD分析

本研究采用Li等人描述的方法获取MDPs的XRD图谱，并稍作修改。使用广角X射线衍射仪（D8 Advance，Bruker，德国）测定MDPs的结晶度。仪器操作条件为40 kV和40 mA，使用Cu Kα辐射源。在2θ范围5°至80°内以5°/min的扫描速度收集数据。

2.5.5 氨基酸组成分析

根据Tian等人描述的方法测定MDPs的氨基酸组成，并稍作修改。使用自动氨基酸分析仪（Model 835–50，Hitachi，日本东京）进行分析。在分析之前，MDPs样品用6 M盐酸（HCl）在110°C下水解24小时。使用外标确保氨基酸的准确定量。

2.5.6 SEM分析

将冻干的MDPs粉末用胶带固定在样品台上，并镀上金层。使用EVO18扫描电子显微镜（Zeiss，德国奥伯科亨）在200倍和1000倍放大倍数下观察MDPs的微观形态。

2.6 MDPs抗氧化活性测定

2.6.1 DPPH清除活性测定

根据Gharehbeglou等人的方法评估MDPs的DPPH自由基清除能力，并稍作修改。简要步骤如下：将肽样品溶解在去离子水中，得到不同浓度的溶液。然后，将40.0 μL各MDPs溶液与160.0 μL DPPH乙醇溶液（0.4 mM）混合。充分混合后，反应混合物在黑暗中孵育25分钟。使用分光光度计（U-2901，日立有限公司，日本东京）在517 nm处测量吸光度。使用抗坏血酸（Vc）作为阳性对照。DPPH自由基清除活性计算公式如下：

DPPH自由基清除率 (%) = [ (A_空白对照 - A_样品) / A_空白对照 ] × 100

其中，A_空白对照代表去离子水与DPPH溶液混合物的吸光度，A_样品代表MDPs溶液与DPPH溶液混合物的吸光度。

2.6.2 羟基自由基清除活性测定

根据Liu等人描述的方法测定羟基自由基清除活性，并稍作修改。简要步骤如下：将0.2 mL不同浓度的MDPs溶液与0.1 mL 10 mM FeSO₄、0.5 mL 10 mM水杨酸-乙醇溶液和0.2 mL 10 mM H₂O₂混合。充分混合后，反应混合物在37°C黑暗中孵育1小时。然后使用分光光度计（U-2901，日立有限公司，日本东京）在510 nm处测量吸光度。使用Vc作为阳性对照。羟基自由基清除活性计算公式如下：

羟基自由基清除率 (%) = [ (A_空白对照 - A_样品) / A_空白对照 ] × 100

其中，A_空白对照代表空白对照组的吸光度，A_样品代表样品组的吸光度。

2.6.3 还原力测定

根据Deng和Huang的方法测定还原力，并稍作修改。简要步骤如下：将1.0 mL不同浓度的MDPs溶液与1.0 mL磷酸盐缓冲液（pH 6.6）和1.0 mL铁氰化钾（K₃Fe(CN)₆）溶液混合。将混合物充分涡旋，然后在50°C水浴中孵育25分钟。孵育后，加入1.0 mL三氯乙酸（TCA, 10% w/v）终止反应。将混合物离心，收集2.0 mL上清液。随后，向上清液中加入2.0 mL去离子水和0.4 mL氯化铁（FeCl₃, 1% w/v）溶液。充分混合后，使用分光光度计（U-2901，日立有限公司，日本东京）在700 nm处测量吸光度。使用Vc作为阳性对照。

2.7 统计分析

数据以平均值±标准差表示（n = 3 或 n = 5，代表样本数），并使用SPSS 13.0软件（IBM，美国纽约）进行统计分析。响应面实验使用Design Expert V8.0.6.1软件进行。为比较组间差异，采用单因素方差分析（ANOVA），随后使用IBM SPSS Statistics 21软件进行Tukey检验。此外，在适当情况下应用Fisher's F检验或独立样本t检验。当p < 0.05时，认为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 适宜蛋白酶的确定

本研究使用六种蛋白酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶和风味蛋白酶）水解家蝇幼虫蛋白。评估了水解产物的DPPH自由基清除活性。清除活性顺序如下：中性蛋白酶处理组（93.8%）> 胃蛋白酶处理组（89.6%）> 风味蛋白酶处理组（88.6%）> 木瓜蛋白酶处理组（86.8%）> 胰蛋白酶处理组（53.2%）> 碱性蛋白酶处理组（29.7%）> 未水解对照组（23.2%）。

3.2 不同酶解条件对MDPs DPPH自由基清除率的影响

首先研究了不同酶解时间对MDPs DPPH自由基清除率的影响。实验条件设定为：温度维持在40.0°C，酶添加量为5000.0 U/g，pH为6.0。结果表明，MDPs的DPPH自由基清除率随水解时间的延长而增加。具体而言，在4.0小时时，清除率显著增加至69.5% ± 3.1%。然而，超过此时间点后，清除率略有下降。因此，选择4.0小时作为后续实验的最佳水解时间。

通过将温度从25.0°C变化到65.0°C，详细评估了温度对MDPs DPPH自由基清除率的影响。其他参数保持不变：时间（4.0 h）、酶添加量（5000.0 U/g）和pH（6.0）。结果表明，温度从25.0°C升高到45.0°C显著提高了MDPs的DPPH自由基清除率（p ≤ 0.05），最高达到71.6% ± 3.3%。然而，温度从45.0°C进一步升高到65.0°C导致清除率显著下降（p ≤ 0.05）。

为全面评估酶添加量对MDPs DPPH自由基清除率的影响，测试了3000.0、4000.0、5000.0、6000.0和7000.0 U/g的添加量。所有其他条件保持不变：水解时间4.0 h，温度45.0°C，pH 6.0。随着酶添加量的增加，DPPH自由基清除率呈现一致的上升趋势，在5000.0 U/g时达到最大值77.0% ± 3.1%。超过此最佳添加量后，清除率仅略有增加。

还研究了pH对MDPs DPPH自由基清除率的影响。将pH调整至5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，同时严格控制其他参数：水解时间（4.0 h）、温度（45.0°C）和酶添加量（5000.0 U/g）。结果揭示了一个明显的趋势：清除率在5.0至6.0之间显著增加，随后随着pH的进一步升高而逐渐降低。在pH 6.0时达到最高DPPH自由基清除率72.9% ± 2.2%。

3.3 MDPs酶解参数的优化

3.3.1 模型拟合

不同实验条件下MDPs的DPPH自由基清除率及其相互作用，以及相应的响应值详见表1。使用BBD评估了不同酶解参数（时间、温度、酶添加量和pH）对MDPs DPPH自由基清除率的影响。该设计包括四个因素，每个因素三个水平。在中心点包含五个重复以估计纯误差并评估模型稳定性。此外，这些中心点重复用于评估实验过程的可重复性和内在变异性。

3.3.2 模型拟合与充分性评估

应用多元回归分析处理实验数据。使用二阶多项式模型建立自变量（X）与因变量响应（Y）之间的关系：

Y = β₀ + Σβ_iX_i + Σβ_iiX_i² + Σβ_ijX_iX_j

其中，X₁ = 时间（小时），X₂ = 温度（°C），X₃ = 酶添加量（U/g），X₄ = pH。

方差分析（ANOVA）结果显示，模型的F值为19.76（p ≤ 0.0001），表明与MDPs的DPPH自由基清除率存在高度显著的相关性。失拟检验的p值为0.4408（p ≥ 0.05），表明模型拟合良好。这些结果证实了模型的统计可靠性。

此外，调整后的决定系数（R2_adj）为0.9036，决定系数（R2）为0.9518。变异系数（C.V.）较低（1.32%），证明了实验数据的高重现性和可靠性。如表2所示，所有线性项（X₁, X₂, X₃, X₄）、二次项（X₁², X₂², X₃², X₄²）以及交互项X₁X₃和X₃X₄均具有统计学显著性（p ≤ 0.05）。

3.3.3 响应面分析

为全面理解不同因素对结果的影响，使用模型3D响应面图分析数据。仔细检查这些图以确定最大化MDPs DPPH自由基清除率的最佳值。同时使用3D响应面图和等高线图来准确阐明变量之间的复杂关系。3D图中观察到的视觉高程作为每对实验变量之间相互作用的指标。

时间与温度、时间与酶添加量、时间与pH对MDPs DPPH自由基清除率的联合效应如图所示。这些表征显示，温度对清除率的影响比时间、酶添加量或pH更显著。具体而言，温度的影响最为显著：从35.0°C升高到45.0°C导致DPPH自由基清除率呈指数级显著上升。然而，温度超过45.0°C至65.0°C，且pH从6.0升高到9.0时，清除率大幅下降，表明这些因素之间存在复杂的非线性相互作用。

温度与酶添加量以及温度与pH对DPPH自由基清除率的影响如图所示。此外，当酶添加量从4000.0增加到5000.0 U/g且pH从5.0调整到6.0时，清除率逐渐提高。还分析了酶添加量与pH之间的相互作用。

3.3.4 模型验证

模型确定的最大化MDPs DPPH自由基清除率的最佳条件如下：时间3.2 h，温度42.9°C，酶添加量5283.3 U/g，pH 6.4。使用略微调整的实际值对这些条件进行了实验验证：时间3.2 h，温度43.0°C，酶添加量5300.0 U/g，pH 6.4。在这些优化条件下，DPPH自由基清除率达到70.9% ± 0.1%。预测值（71.4%）与实验结果之间未观察到显著差异（p ≥ 0.05）。

3.4 结构特性

3.4.1 粒径和Zeta电位

MDPs、MDPs_>?10?kDa和MDPs_{的粒径分别确定为1925.9 ± 49.8 nm、542.3 ± 62.1 nm和5.4 ± 0.6 nm。Zeta电位是评估胶体或聚合物溶液分散特性及稳定性的重要参数。MDPs、MDPs>?10?kDa和MDPs的绝对Zeta电位值分别为-9.9 ± 1.6 mV、-22.5 ± 2.9 mV和-11.8 ± 1.3 mV，表明各组分间具有相似的表面电荷特性。}

3.4.2 紫外-可见（UV-vis）光谱及内源荧光光谱

MDPs、MDPs_>?10?kDa和MDPs_{的UV-Vis吸收光谱大体相似。所有三个样品最显著的吸收发生在240至290 nm区域。这导致所有组分的吸收峰均显著增强。荧光光谱是检测肽三级结构中细微结构和构象变化的合适技术，特别是当存在色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸等生色团时。MDPs、MDPs>?10?kDa和MDPs在300至375 nm光谱范围内均表现出显著较高的荧光强度。}

3.4.3 FT-IR光谱

FT-IR分析是研究蛋白质和肽结构的基本方法。三种肽产品的红外光谱总体相似。识别的具体波数位置如下：(1) 酰胺A带在3297 cm^?1（MDPs）和3305 cm^?1（MDPs_>?10?kDa和MDPs_{），对应于N-H伸缩振动或涉及N-H基团的氢键；(2) 酰胺B带在2930 cm^?1；(3) 酰胺I带在1666 cm^?1，归因于C=O伸缩振动或与羧基相关的氢键；(4) 酰胺II带在1404 cm^?1，表明N-H弯曲振动和C-N伸缩振动；(5) 酰胺III带在1250 cm^?1，代表C-N伸缩振动和N-H变形振动，或甘氨酸和脯氨酸侧链中亚甲基的振动。在MDPs样品中，在3297、1666、1404、1250和1049 cm^?1处观察到明显的蛋白质相关峰。3000至3750 cm^?1范围内的N-H和O-H伸缩振动与肽骨架内的氢键有关。这些氢键在稳定肽二级结构中起关键作用。此外，1666 cm^?1处的吸收峰提示C=O伸缩振动，而1404 cm^?1处的峰可能归属于N-H弯曲以及C-N伸缩振动。}

基于FT-IR数据的二级结构分析显示，对于MDPs，主要构象是α-螺旋（40.5%），其次是β-折叠（32.4%）和β-转角（27.1%）。对于MDPs_>?10?kDa，α-螺旋含量最高（42.6%），其次是β-折叠（29.8%）和β-转角（27.6%）。类似地，MDPs_{显示出主要的α-螺旋结构（43.1%），伴随有β-折叠（30.1%）和β-转角（26.8%）。总体而言，MDPs、MDPs>?10?kDa和MDPs的二级结构高度相似，表明结构特征在整个分离过程中得到了很好的保留。这一详细分析突出了MDPs复杂的结构组织，并为其分子结构和功能特性提供了有价值的见解。}

3.4.4 广角XRD实验

XRD分析是一种广泛用于确定颗粒是结晶还是无定形的方法，常用于检查肽的结构构象。本研究采用XRD来精确测定MDPs、MDPs_>?10?kDa和MDPs_{的晶体结构。在2θ值为26°、32°、46°和57°处观察到明显的衍射峰。衍射图案的相似性表明MDPs、MDPs>?10?kDa和MDPs的晶体结构具有可比性。值得注意的是，所有三个样品都表现出一个显著的衍射峰，表明其具有高结晶度和良好的组织结构。}

3.4.5 MDPs的氨基酸分析

氨基酸组成是天然肽质量的关键决定因素。精确分析了MDPs中17种氨基酸的比例。MDPs、MDPs_>?10?kDa和MDPs_{之间的氨基酸含量未观察到显著差异。两个组分均显示出高营养价值，是卓越的蛋白质来源。MDPs富含天冬氨酸、谷氨酸和色氨酸。此外，MDPs>?10?kDa和MDPs都富含谷氨酸、组氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸。}

3.4.6 MDPs的SEM分析

SEM是分析肽微观结构的常用方法。使用SEM广泛检查了MDPs、MDPs_>?10?kDa和MDPs_{的形态。观察到这些材料在尺寸和表面形态上存在显著差异。在1000倍放大倍数}