L-茶氨酸通过促进尿葡萄糖排泄抑制小鼠口服葡萄糖耐量试验中血糖升高及其机制研究

本研究揭示了L-茶氨酸（L-theanine）在口服葡萄糖耐量试验（OGTT）中通过促进尿葡萄糖排泄显著抑制小鼠血糖升高的新机制。高剂量（1000 mg/kg）L-茶氨酸干预不仅降低血糖水平，还增加多种氨基酸（如Glu、Gln、Leu等）和钠离子（Na+）的尿排泄，提示其可能通过竞争性抑制肾脏近端小管氨基酸转运体（如ASCT2、EAAC1）和钠依赖葡萄糖转运蛋白（SGLTs），减少葡萄糖重吸收。该发现为L-茶氨酸作为膳食补充剂调控餐后高血糖和糖尿病预防提供了重要理论依据。

　　

引言

肥胖和高血糖人群的不断增加已成为当今社会的主要问题。预防肥胖和高血糖对于降低糖尿病发病风险至关重要。近年来，多种具有改善肥胖和高血糖功能的特定保健用食品和补充剂已上市。L-茶氨酸是绿茶中含有的一种氨基酸，其结构类似于L-谷氨酰胺（L-glutamine），是茶的鲜味成分。L-茶氨酸作为一种膳食补充剂，已知具有放松和改善睡眠的效果，近年来其抗肥胖和抗糖尿病潜力备受关注。

尽管多项研究报道饮茶对人类肥胖和糖尿病有效，但L-茶氨酸与糖尿病关联的研究历史较短。2009年Ninomiya等人进行的一项临床研究表明，L-茶氨酸代谢物血液浓度的增加使2型糖尿病发病风险降低约30%，但该报告未描述L-茶氨酸降低2型糖尿病发病风险的机制。少数在大鼠和小鼠中进行的研究阐明了L-茶氨酸抗肥胖和抗糖尿病作用的机制。Yan等人报道，给大鼠施用L-茶氨酸2周可抑制肠道SGLT3和GLUT5 mRNA的表达，抑制小肠葡萄糖吸收，降低血清葡萄糖和胰岛素浓度。Peng等人也报道，用L-茶氨酸处理小鼠10周可激活脂肪细胞中的AMPK，促进Prdm16表达，使能量储存的白色脂肪组织转变为能量消耗的棕色脂肪组织，改善高脂饮食摄入引起的体重增加和胰岛素敏感性。这些报告表明，L-茶氨酸通过影响血糖水平和胰岛素分泌，在大鼠和小鼠中具有抗肥胖和抗糖尿病作用。然而，尽管部分报告旨在阐明对糖吸收和代谢的影响机制，但尚无报告阐明对血糖水平的直接影响或现象。

因此，本研究旨在阐明L-茶氨酸摄入是否抑制血糖水平升高，并重点关注其对尿葡萄糖排泄的影响作为机制之一。研究考察了L-茶氨酸摄入对小鼠口服葡萄糖耐量试验（OGTT）期间血糖和胰岛素水平的影响，并测量了试验期间尿氨基酸浓度以及尿葡萄糖浓度。已知重吸收尿中排泄的葡萄糖和氨基酸的转运蛋白（如SGLTs和ASCT2）共同转运钠离子（Na⁺）。因此，本研究还测量了尿钠浓度，并评估了其对葡萄糖和氨基酸重吸收的影响。

材料与方法

实验试剂与设备

L-茶氨酸购自Taiyo Kagaku Co. Ltd.（日本三重）。所有用于鉴定尿中氨基酸的试剂，包括氨基酸标准溶液H型，均购自FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation（日本大阪）。用于测量小鼠血糖水平的测量设备和芯片购自Terumo Corporation（日本东京）。用于测量小鼠血液胰岛素浓度的试剂盒购自Morinaga Institute of Biochemistry Co. Ltd.（日本神奈川）。用于测量尿钠浓度的设备LAQUA twin Na-11购自HORIBA Ltd.（日本京都）。尿葡萄糖浓度由Oriental Yeast Co. Ltd.（日本东京）使用电极法进行定量。

动物与伦理考虑

雄性Std-ddY小鼠（5-7周龄，平均体重30.3克）购自SHIMIZU Laboratory Supplies Co. Ltd.（日本京都）。所有小鼠在受控条件下饲养（温度：22°C ± 2°C；湿度：55% ± 5%；12小时光/暗循环），自由获取食物和水。本研究经Setsunan大学机构动物护理和使用委员会批准并依据其指南进行（批准号：K22-27和K23-26）。

OGTT及血糖和血胰岛素水平测量

将小鼠分为对照组和治疗组。治疗组进一步分为两个亚组，分别接受100或1000 mg/kg剂量的L-茶氨酸。禁食6小时后，对照组口服纯水，而治疗组通过口服灌胃接受L-茶氨酸。在口服纯水或L-茶氨酸15分钟后，通过口服2 g/kg体重的葡萄糖溶液开始OGTT。在-15分钟（口服纯水或L-茶氨酸后立即）、0分钟（葡萄糖给药后立即）以及葡萄糖给药后15、30、60和120分钟测量血糖水平。同时，在测量血糖时采集血样，使用小鼠/大鼠胰岛素ELISA试剂盒测定血浆胰岛素水平。

尿液收集及尿葡萄糖和钠浓度测量

使用购自TECNIPLAST Co. Ltd.（日本东京）的个体小鼠代谢笼收集尿液。具体而言，在口服纯水或L-茶氨酸至OGTT开始之间的15分钟内（-15至0分钟）以及OGTT开始后每30分钟（0-30、30-60、60-90、90-120、120-150和150-180分钟）收集尿液。从代谢笼中收集尿液样本，使用钠离子测量设备测量钠离子浓度。葡萄糖浓度由Oriental Yeast Co. Ltd.使用基于电极的方法测定。

尿中氨基酸分析及统计处理

使用PITC方法根据我们先前建立并报道的方法（Yamaura等人，2024）对获得的尿液样本中的L-茶氨酸和其他氨基酸进行分析和定量。实验中获得的值使用Wilcoxon秩和检验进行统计评估，当显著性水平p小于0.05时认为差异显著。

结果

OGTT期间血糖和血胰岛素水平

OGTT期间血糖水平的变化如图1a所示，相同时间点的相应胰岛素浓度如图1b所示。这些结果的数值在表1中提供。L-茶氨酸100 mg/kg组的血糖水平与对照组无显著差异。相比之下，L-茶氨酸1000 mg/kg组在15、30、60和120分钟时的血糖水平显著低于对照组。对照组和1000 mg/kg L-茶氨酸处理组之间的血胰岛素水平无显著差异。两组在葡萄糖给药后15分钟时均短暂增加至约1.0 ng/mL。胰岛素浓度水平在葡萄糖给药后30分钟下降至约0.4 ng/mL，并在此后直至120分钟保持不变。

OGTT期间尿排泄量和尿葡萄糖浓度

OGTT期间各时间点的尿排泄量在表2中呈现，相应的尿葡萄糖浓度如图2和表3所示。OGTT期间尿量在L-茶氨酸1000 mg/kg或100 mg/kg组与对照组之间未观察到显著差异。所有组中，-15至0分钟间隔期间尿量较低，并在30至60分钟之间趋于增加。在1000 mg/kg L-茶氨酸组中，0-30分钟和30-60分钟间隔期间的尿葡萄糖浓度显著高于对照组。在100 mg/kg组中，尿葡萄糖浓度在30-60分钟达到峰值；然而，与其他时间段相比，与对照组无显著差异。此外，100 mg/kg组在150-180分钟期间的尿葡萄糖浓度高于对照组。

OGTT期间尿L-茶氨酸浓度

尿L-茶氨酸浓度如图3a、b和表4所示，各时间点L-茶氨酸排泄百分比（以180分钟内总排泄量归一化为100%）如图3c所示。100 mg/kg和1000 mg/kg组尿L-茶氨酸浓度均在0-30分钟尿液中达到最大值。1000 mg/kg组的中位峰值浓度约为100 mg/kg组的三十倍。每小时L-茶氨酸排泄量相对于180分钟内总排泄量的百分比在两组中相似，葡萄糖给药后60分钟内两组均为74%，随后排泄率也相似。

180分钟内除L-茶氨酸外其他氨基酸的尿浓度

测量了谷氨酸（Glu）、谷氨酰胺（Gln）、亮氨酸（Leu）、丝氨酸（Ser）、蛋氨酸（Met）、甘氨酸（Gly）、缬氨酸（Val）、赖氨酸（Lys）、丙氨酸（Ala）、苏氨酸（Thr）、异亮氨酸（Ile）和酪氨酸（Tyr）的尿浓度。这些氨基酸的尿浓度如图4和表5所示。在施用100 mg/kg L-茶氨酸的组中，这些氨基酸的浓度与对照组相比无显著差异。然而，在施用1000 mg/kg L-茶氨酸的组中，Glu、Gln、Leu、Ser、Met、Gly、Val和Lys的尿浓度显著高于对照组，并且比对照组增加了约2至10倍。另一方面，Ala、Thr、Ile和Tyr的浓度在任何组间均无显著差异。

OGTT期间尿钠浓度

OGTT期间的尿钠浓度（Na⁺）如图5和表6所示。对照组中，禁食期间随机尿液的Na⁺浓度约为20 mEq/L。OGTT开始后，在-15至0、0-30、30-60和60-90分钟期间，Na⁺浓度在大约15至22 mEq/L之间波动。90分钟后，浓度增加，在90-120分钟和120-150分钟期间达到约45 mEq/L，在150-180分钟期间达到85 mEq/L。在施用100 mg/kg的组中，尿Na⁺浓度与对照组相比无显著差异，趋势相似。在施用1000 mg/kg的组中，-15至0分钟（茶氨酸给药后立即）的Na⁺浓度高于对照组和100 mg/kg组。然而，在90-120分钟期间的尿液中，Na⁺浓度最低，低于27 mEq/L。尽管未观察到显著差异，但尿Na⁺浓度的增加被延迟，在120分钟后才观察到增加。在150-180分钟期间收集的尿液中，施用1000 mg/kg的组显示出最低的Na⁺浓度，约为68 mEq/L。

讨论

尽管本研究存在样本量相对较小、L-茶氨酸剂量远高于典型人类摄入量以及效果仅在口服葡萄糖耐量试验中评估等局限性，但它是首个报告L-茶氨酸作为改善餐后高血糖的补充剂潜力的研究。此外，尽管仅考察了100和1000 mg/kg两个剂量，但评估这两个预期产生显著差异的剂量使我们能够深入了解L-茶氨酸的作用位点。我们发现，在1000 mg/kg时，L-茶氨酸降低了葡萄糖给药后血糖水平的升高，并增加了尿中葡萄糖、Glu、Gln、Leu、Ser、Met、Gly、Val和Lys的排泄，与对照组和100 mg/kg L-茶氨酸组相比。这些抑制血糖水平升高和增加氨基酸（如Glu）尿排泄的结果，让人联想到Kano等人报道的体重与氨基酸转运蛋白之间关系的文章。Kano等人报道，敲除形成氨基酸转运蛋白（如BAT1）的伴侣蛋白（如“Collectrin”）基因的小鼠能够减少体重增加（Kano等人，2024）。我们的结果表明，L-茶氨酸可能被肾脏近端小管中重吸收Gln等的相同转运蛋白重吸收。此外，施用1000 mg/kg L-茶氨酸组的OGTT结果显示，尿中排泄的Na⁺量持续低于其他组，表明L-茶氨酸可能被Na⁺驱动的氨基酸转运蛋白重吸收（Avissar等人，2001；Hediger等人，2013；Kanai等人，2013；Pizzagalli等人，2021；Porton等人，2013；Shayakul等人，1997；Verrey等人，2009）。据推测，当肾脏小管中存在大量L-茶氨酸时，例如以1000 mg/kg剂量给药时，它会降低近端小管中的Na⁺浓度，并间接抑制Na⁺驱动的葡萄糖转运蛋白（SGLTs），从而导致大量葡萄糖从尿中排泄（图6）（Wright，2001；Wright等人，2011）。

我们的新发现使我们能够深入讨论迄今为止报道的论文。Yan等人研究L-茶氨酸对血糖水平和胰岛素分泌影响的报告显示，L-茶氨酸降低了大鼠的血清葡萄糖和胰岛素浓度（Yan等人，2017）。与Yan等人的发现相反，我们的研究未显示血胰岛素水平下降，这可能是因为我们的数据来自OGTT。然而，尿葡萄糖排泄增强可能导致血糖水平持续降低，这可能最终解释Yan等人观察到的结果。Peng等人也报道，L-茶氨酸通过调节脂肪细胞中的AMPK，改善了高脂饮食喂养小鼠的体重增加和胰岛素敏感性（Peng等人，2021）。将我们的结果与Kano等人的结果相结合表明，体重增加抑制和胰岛素敏感性改善可能是涉及氨基酸转运蛋白的糖利用效率降低的结果（Kano等人，2024）。基于以上，L-茶氨酸导致更多葡萄糖从尿中排泄并抑制血糖水平升高的事实可能参与能量代谢，抑制体重增加并改善高血糖状况。

本研究揭示L-茶氨酸增强尿葡萄糖排泄至影响OGTT血糖升高的程度，但未能阐明该效应的机制。此外，在本研究中，L-茶氨酸的尿排泄率未因给药剂量而有显著差异。另外，考虑到在施用1000 mg/kg L-茶氨酸的组中浓度增加的氨基酸是Glu、Gln、Leu、Ser、Met、Gly、Val和Lys，表明尽管L-茶氨酸被氨基酸转运蛋白（如ASCT2和EAAC1）重吸收，这些转运蛋白使用排泄增加的氨基酸作为转运底物，但转运蛋白的特异性并不高（Avissar等人，2001；Pizzagalli等人，2021；Porton等人，2013；Shayakul等人，1997）。如果L-茶氨酸对ASCT2和EAAC1等转运蛋白具有高度特异性，则预期在100 mg/kg剂量下，L-茶氨酸比1000 mg/kg剂量下被更有效地重吸收，并且在100 mg/kg时排泄率较低。此外，在100 mg/kg给药情况下，可以设想L-茶氨酸的重吸收将优先于其他中性氨基酸（如Gln）的重吸收，从而促进那些氨基酸的尿排泄。然而，由于这些可能性未得到我们结果的支持，表明与其他中性氨基酸相比，L-茶氨酸可能对这些转运蛋白不具有高度特异性。表明L-茶氨酸可能通过某种类型的氨基酸转运蛋白以钠（Na⁺）依赖的方式在肾脏中被重吸收，从而抑制葡萄糖重吸收。此外，Clemmensen等人报道，给小鼠施用1000 mg/kg精氨酸（Arg）可降低血糖水平；然而，这种效应归因于胰岛素和胰高血糖素样肽1分泌增强，未研究通过肾脏的葡萄糖排泄（Clemmensen等人，2013）。值得注意的是，我们未发现表明大量摄入Gln或Gly（本研究中茶氨酸给药后排泄受影响）影响血糖水平的报告。由于L-茶氨酸不是蛋白质氨基酸，不参与能量代谢，它可能在不被代谢的情况下促进尿葡萄糖排泄，可能导致血糖水平降低和体重减轻。

最后，考虑L-茶氨酸降血糖效应的相对强度很重要。给小鼠施用1000 mg/kg L-茶氨酸导致尿葡萄糖浓度超过1000 mg/dL；然而，根据Lee等人关于达格列净（dapagliflozin）的报告，这种效应似乎远弱于抗糖尿病药物（Lee等人，2018）。Lee等人报道了在C57BL/6小鼠中施用1 mg/kg剂量的SGLT2抑制剂达格列净后的尿葡萄糖排泄。根据他们的发现，在类似于我们的OGTT期间，施用1 mg/kg达格列净导致约24小时内尿葡萄糖排泄量为10.7 mg/g体重。比较我们3小时排泄数据和单位时间葡萄糖排泄率，1 mg/kg达格列净诱导的尿葡萄糖排泄量约为1000 mg/kg L-茶氨酸的八倍。鉴于这些考虑，我们的研究结果表明，虽然L-茶氨酸不太可能作为糖尿病治疗剂，但它可能有潜力作为改善餐后高血糖的补充剂。由于L-茶氨酸是人们熟悉的茶中氨基酸，它可能更易被希望预防糖尿病的人接受。虽然每日饮茶可能有助于糖尿病治疗，但准确监测糖尿病治疗过程可能需要检查绿茶摄入量。因此，进一步阐明L-茶氨酸将葡萄糖排泄到尿中的机制将很重要。

结论

L-茶氨酸通过促进尿中葡萄糖排泄，抑制小鼠OGTT期间发生的血糖水平升高。虽然需要进一步研究以阐明潜在机制，但我们的研究结果表明，L-茶氨酸具有抑制血糖水平升高的功能，并有潜力为糖尿病预防做出贡献。

作者贡献

材料准备和数据收集与分析由Shinnosuke Yamaura和Koki Sadamori进行。手稿的初稿由Koji Komori撰写。Kou Kawada和Nobuyuki Kuramoto对先前版本的手稿进行了评论。Reiko Konishi、Takashi Majima和Akira Mukai参与了教学讨论或重要智力内容的批判性审查。Kyosuke Uno和Koichi Kawada参与了数据的分析和解释以及论文的批判性审查。所有作者阅读并批准了手稿的最终版本。

致谢

这项工作得到了日本糖尿病教育与护理协会的资助（资助号：2022-FND-027）。我们要感谢Editage（www.editage.jp）的英语语言编辑。

利益冲突

作者声明无利益冲突。