骨化三醇通过调控Ang/Tie2通路与肺泡毛细血管屏障完整性减轻卵巢切除并脓毒症小鼠急性肺损伤的作用机制研究

本文探讨了骨化三醇（calcitriol）在卵巢切除合并脓毒症小鼠模型中通过改善血管生成素（Ang）/酪氨酸激酶受体（Tie2）信号失调、增强肺泡毛细血管屏障完整性以及抑制铁死亡（ferroptosis）和铜死亡（cuproptosis）来减轻急性肺损伤（ALI）的作用，为绝经后肥胖女性脓毒症相关肺损伤提供了潜在治疗策略。

　　

1. 引言

绝经是女性衰老过程中的自然现象，伴随卵巢功能衰退和雌激素水平下降。雌激素缺乏易导致肥胖和多种代谢紊乱。研究表明，围绝经期和绝经后女性常出现全身性炎症反应增强、脂质过氧化及抗氧化能力改变。在美国，约70%的围绝经期女性超重或肥胖。肥胖本身是一种伴有慢性低度炎症、氧化应激和免疫调节紊乱的疾病。绝经合并肥胖可能加重危重症状态下器官损伤的严重程度。

脓毒症是重症监护病房中常见的致死性综合征，由细菌及其毒素引发免疫失调和多器官功能衰竭。在受损器官中，肺部最易受累。脓毒症所致肺损伤的主要机制之一是微血管渗漏，源于内皮功能障碍和屏障完整性破坏。血管生成素（Ang）/酪氨酸激酶含免疫球蛋白样和表皮生长因子样结构域2（Tie2）信号通路在调节血管稳定性和完整性中起关键作用。Ang/Tie2轴紊乱导致内皮激活和血管渗漏，进而引发脓毒症。另一方面，脓毒症期间的强烈代谢应激可能导致离子紊乱，参与脓毒症相关器官损伤。铁死亡和铜死亡是金属离子超载导致的程序性细胞死亡形式。铁死亡以铁离子积聚和脂质过氧化产物堆积为特征；铜死亡则是铜依赖性细胞死亡，源于铜与三羧酸循环中脂酰化酶的直接结合，导致蛋白毒性应激。既往研究显示，铁死亡促进急性肺损伤（ALI）发展，抑制铁死亡可减轻脓毒症诱导的ALI。此外，铜死亡相关基因与脓毒症诱导的ALI的发生和进展显著相关。

维生素D（VD）是一种具有抗炎和免疫调节特性的脂溶性维生素。既往研究表明，活性VD形式——1,25(OH)₂D₃（骨化三醇）干预可调节T细胞亚群稳态和肾素-血管紧张素系统相关信号通路，从而减轻脓毒症和poly(I:C)诱导的ALI。本研究探讨了骨化三醇对肥胖绝经小鼠脓毒症并发症中ALI相关的Ang/Tie2信号失调、屏障功能损害及离子紊乱的影响。同时研究了骨化三醇对铁死亡和铜死亡相关ALI的作用。通过卵巢切除术模拟绝经期雌激素缺乏，再给予高脂饮食（HFD）诱导肥胖。采用盲肠结扎穿孔（CLP）诱导小鼠多微生物脓毒症，该模型广泛用于研究脓毒症相关器官损伤及其机制。近期研究发现，骨化三醇可减轻脓毒症诱导的肝脏铁死亡，维生素D受体（VDR）参与抑制气道上皮铁死亡从而改善ALI。尽管目前尚无研究探讨VD在铜死亡中的作用，但铁死亡与铜死亡在发生机制、信号通路和细胞代谢方面相互关联。我们假设骨化三醇可通过调节Ang/Tie2轴、改善肺泡毛细血管屏障完整性、减轻铁死亡和铜死亡来缓解卵巢切除肥胖小鼠脓毒症并发症中的ALI。

2. 材料与方法

2.1. 动物

实验使用雌性C57BL/6小鼠。所有动物购自国家实验动物中心（NLAC，台北，台湾），饲养于22±2°C、12小时光暗循环控制的环境中。标准啮齿类动物饲料和自来水自由摄取6个月（体重约25克）。6月龄小鼠被视为中年鼠。小鼠在实验前于台北医学大学（TMU）动物实验中心适应1周。动物实验操作遵循国家实验动物使用和护理指南，并经TMU机构动物护理和使用委员会批准（LAC-2023-0207）。

2.2. 实验设计

适应1周后，将体重相近的小鼠随机分为三组：OB组（假卵巢切除手术+高脂饮食，n=8）；OVSS组（卵巢切除+HFD+CLP+尾静脉注射生理盐水，n=20）；OVSD组（卵巢切除+HFD+CLP+尾静脉注射骨化三醇410 ng/kg体重，n=20）。骨化三醇剂量参考临床研究，证明在脓毒症患者中具有良好的耐受性和益处。剂量根据实践指南进行人和小鼠之间的换算。该剂量在危重小鼠中已证实具有免疫调节和抗炎作用。双侧卵巢切除术于6月龄时进行，小鼠用2.5%异氟烷麻醉，背腰区皮肤切口，钳夹并切除卵巢，切口处滴注0.25%布比卡因镇痛，皮肤连续缝合。假手术组操作相同但不切除卵巢。术后，实验组小鼠给予HFD 12周。HFD由Research Diets公司提供，成分见表1。饮食脂肪含量和肥胖诱导持续时间参考既往卵巢切除+HFD rodent模型。随后，对OVSS和OVSD组进行CLP诱导脓毒症。CLP操作遵循先前描述的程序：麻醉小鼠后，在盲肠远端30%处结扎，用23G针穿刺盲肠，并将少量粪便涂于腹腔，缝合前切口滴注布比卡因。CLP术后皮下注射无菌盐水补液。恢复期间所有小鼠自由饮水和原饮食。12周末，肥胖组小鼠麻醉后心脏穿刺处死，脓毒症组小鼠于CLP后24或72小时处死（每个时间点n=10）。选择这些时间点是因为24小时被认为是CLP模型的晚期，炎症反应和远程器官损伤可能持续至72小时。血浆样品经离心后获得。部分肺组织用于组织学检查，其余部分液氮冷冻直至进一步分析。生存研究共使用48只小鼠（OVSS，n=28；OVSD，n=20），生存情况每12小时记录一次直至CLP后72小时。

2.3. 血浆生化参数测量

使用ProcartaPlex多重免疫检测试剂盒（Invitrogen EPXR360-26092-901）分析细胞因子和趋化因子。遵循制造商说明，样本（25μL）在MAGPI平台Milliplex Map上处理，数据用Luminex xPonent软件采集。白细胞介素（IL）-22、C-X-C motif趋化因子配体10（CXCL10）、单核细胞趋化蛋白（MCP）-1和MCP-3结果用配套Analyst软件分析。

2.4. 肺组织Ang/Tie2相关蛋白分析

取30mg肺组织在300μL组织蛋白提取试剂（T-PER；Thermo Fisher Scientific）中匀浆，加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂（Thermo Fisher Scientific）。匀浆物脉冲超声冰浴20-30秒，4°C、12000rpm离心10分钟。收集上清，用Bradford蛋白测定试剂盒（Bio-Rad）测蛋白浓度。Ang1、Ang2、血管内皮生长因子（VEGF）和Tie2用ELISA试剂盒（AVIVA Systems Biology）分析。样本稀释倍数：Ang1 400倍，Ang2和Tie2 1600倍，VEGF 50倍。稀释样本按商业产品protocol加入96孔板。结果根据各样本蛋白水平调整。

2.5. 肺组织紧密连接（TJ）蛋白水平

同上方法获取组织匀浆上清。上清稀释倍数：claudin-5 400倍，zona occludens（ZO）-1和occludin 200倍。用小鼠TJ蛋白1、occludin和claudin ELISA试剂盒（FineTest）分析TJ蛋白。所有操作遵循商业kit指南。数据表示为pg/mg蛋白，蛋白浓度用商业试剂盒（Bio-Rad）测定。

2.6. 肺匀浆脂质过氧化物水平分析

4-羟基壬烯醛（4-HNE）是多不饱和脂肪酸（PUFAs）衍生的主要脂质过氧化产物。上清稀释10倍后，用脂质过氧化4-HNE检测试剂盒（ab238538, Abcam）测4-HNE水平。遵循制造商protocol，在450nm吸光度读数。最终结果根据上清蛋白浓度调整。蛋白水平用Bradford蛋白测定试剂盒（Bio-Rad）测量。

2.7. 肺组织转铁蛋白受体（TFRC）和铁含量

用小鼠转铁蛋白受体ELISA试剂盒（ab243674, Abcam）分析组织TFRC水平。操作如先前报告所述。为分析样本中的亚铁离子（Fe²⁺），使用铁测定试剂盒（ab83366, Abcam）。组织用5倍体积酸性缓冲液（pH 5.5）匀浆，收集上清并用缓冲液稀释200倍，加入5μL铁缓冲液孵育。加入铁探针孵育，在593nm读吸光度。操作遵循说明书和先前描述细节。TFRC和铁浓度通过吸光度值在标准曲线插值确定。上清蛋白水平用Bradford蛋白测定试剂盒（Bio-Rad）分析。

2.8. 肺组织还原型谷胱甘肽（GSH）水平和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）活性

取50mg肺组织在0.5mL缓冲液（含50mM Tris-HCl、5mM EDTA、1mM DTT，pH 7.5）中匀浆。上清中总（t）GSH和氧化型谷胱甘肽（GSSG）浓度用商业试剂盒（Cayman Chemical）测量，如先前报告所述。GSH含量计算为tGSH与GSSG之差。为测GPX4活性，取30mg组织样本在0.3mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）中匀浆，-20°C过夜。进行两次冻融循环破碎细胞膜，离心取上清。上清用ELISA试剂盒（cat. no. OKEH08828, Aviva Systems Biology）分析GPX4活性。详细操作如先前所述。GPX4活性表示为测定结果与空白孔平均值的相对吸光度（450nm）。GSH含量和GPX4活性根据上清蛋白水平调整。蛋白水平用Bradford蛋白测定试剂盒（Bio-Rad）分析。

2.9. 肺组织铜离子分析

取50mg速冻肺组织用松散Dounce匀浆器在500μL缓冲液（含0.1mol/L磷酸钠pH 7.5、0.25mol/L D-蔗糖）中匀浆。上清用铜测定试剂盒（cat. no. MAK127, Sigma–Aldrich）分析铜（Cu²⁺）水平，遵循制造商protocol。最终数据表示为Cu²⁺浓度（μg），根据上清蛋白水平调整。蛋白水平用Bradford蛋白测定试剂盒（Bio-Rad）测量。

2.10. 肺组织信使RNA（mRNA）提取和实时逆转录（RT）定量聚合酶链反应（qPCR）分析

组织匀浆后，用Trizol试剂（Invitrogen）提取总RNA。RNA沉淀溶解于RNase-free水，-80°C保存备用。RNA浓度用分光光度计260和280nm吸光度定量。用RevertAid第一链cDNA合成试剂盒（Thermo Fisher Scientific）合成cDNA。cDNA保存于-80°C直至使用。RT反应条件：65°C 5分钟，42°C 60分钟，70°C 5分钟。mRNA基因用7300实时PCR系统（Applied Biosystems）以SYBR Green I为检测格式进行实时RT-PCR扩增。检测基因包括铁死亡通路相关（核因子E2相关因子2（Nrf2）、铁死亡抑制蛋白1（FSP1）、溶质载体家族7成员11（SLC7A11）、酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）、前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2））和铜死亡相关基因（铁氧还蛋白1（FDX1）、ATP酶铜转运α（ATP7A）、SLC31A1、硫辛酸合酶（LIAS）、二氢硫辛酰胺转乙酰酶（DLAT））。引物基于GenBank数据库序列，由Mission Biotech（台北，台湾）提供。所有引物见表2。反应体系总体积25μL，含Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix（2x）（Thermo Fisher Scientific）、100ng cDNA、各引物40nM。反应程序：50°C 2分钟，95°C 10分钟；95°C 15秒、60°C 1分钟，40循环；最后解离曲线（DC）。以小鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参。相对mRNA表达水平用CT值计算，以CLP后12小时OS组结果归一化。

2.11. 肺组织病理学

肺组织用10%中性磷酸盐缓冲福尔马林固定。组织学评估由盲态兽医病理学家进行。组织切片苏木精-伊红（H&E）染色检查形态学。每个切片捕获200倍放大数字图像。肺损伤严重程度根据既往报告评判：肺泡壁厚度分级0-4；病变百分比分级0-3（0：病变影响<3%面积，1：4%-33%，2：34%-66%，3：>67%）。总体肺损伤评分为两个组织学评分之和。

2.12. 统计分析

研究者在校准参数评估时设盲。所有数据表示为均值±标准误（SEM）。用GraphPad Prism 5统计软件分析数据。生存曲线用log-rank检验比较。各时间点OB和脓毒症组间比较用双因素ANOVA后Bonferroni事后检验。p<0.05认为有统计学意义。

3. 结果

3.1. 实验组肺重

实验组间肺重无差异（图1A）。OVSD-24和OVSS-72组肺重/体重比显著高于OB组。OVSS和OVSD组在两个时间点肺重/体重比无差异（图1B）。

3.2. 骨化三醇治疗降低卵巢切除脓毒症小鼠血浆炎症指标

OVSS组IL-22、CXCL10、MCP-1和MCP-3水平高于OB组。与OVSS组相比，OVSD组在CLP后24或72小时IL-22浓度显著更高，而CXCL10、MCP-1和MCP-3更低（图2）。

3.3. 肺组织Ang/Tie2通路相关蛋白水平

OVSS组Ang1水平和Ang1/Ang2比值显著低于OB组。与OVSS组相比，OVSD组CLP后Ang1和Tie2水平显著更高，Ang2水平更低。OVSD组在两个时间点Ang1/Ang2比值也高于OVSS组（图3A）。OVSS组VEGF水平低于OB组。OVSD组CLP后VEGF水平高于OVSS组（图3B）。

3.4. 骨化三醇增强卵巢切除脓毒症小鼠肺组织VDR表达和TJ蛋白水平

卵巢切除合并脓毒症导致VDR表达及ZO-1、occludin和claudin-5水平降低。骨化三醇治疗显著提高CLP后VDR表达（图4A）和这三种TJ蛋白水平（图4B）。

3.5. 骨化三醇降低卵巢切除脓毒症小鼠肺组织铁含量并改善GSH氧化还原状态

OVSS组CLP后72小时Fe²⁺和TFRC水平高于OB组。在卵巢切除+CLP组中，OVSD组72小时Fe²⁺更低，而24和72小时TFRC水平均低于OVSS组（图5A）。GPX4、GSH和4-HNE水平在OB和OVSS组间无差异。但OVSD组CLP后24小时GPX4和GSH水平更高，24和72小时4-HNE低于OVSS组（图5B）。

3.6. 骨化三醇减轻卵巢切除脓毒症小鼠肺铁死亡

卵巢切除+CLP小鼠SLC7A11和Nrf2表达显著更低，ACSL4表达更高。在卵巢切除+CLP组中，骨化三醇治疗上调SLC7A11、Nrf2和FSP1，下调PTGS2和ACSL4表达水平（24小时或两个时间点）（图6）。

3.7. 骨化三醇减轻卵巢切除脓毒症小鼠肺铜死亡

OVSS组24和72小时Cu²⁺水平和FDX1基因表达显著更高，72小时LIAS和SCL31A表达更高。在卵巢切除+CLP组中，骨化三醇给药小鼠Cu²⁺含量显著更低。FDX1、LIAS、DLAT和SCL31A基因表达水平更低，而ATP7A表达更高（24小时或两个时间点）（图7）。

3.8. 肺组织病理学发现和生存率

H&E染色组织学发现显示，肥胖小鼠可见病变和肺泡壁增厚，而卵巢切除合并脓毒症加重肺损伤。骨化三醇给药减轻肺损伤评分（图8A,B）。生存率显示，OVSD组24和36小时全部存活（100%），48小时75%存活，持续至CLP后72小时。OVSS组24、36、48、60和72小时生存率分别为87.5%、62.5%、50%、37.5%和25%。OVSD组生存率显著高于OVSS组（图8C）。

4. 讨论

本实验重点关注肥胖小鼠并发卵巢切除和脓毒症。这一重点基于估计显示围绝经期女性超重或肥胖倾向高。未纳入瘦对照组，因既往研究已证明肥胖小鼠比瘦小鼠炎症反应更强。其他研究表明肥胖小鼠对脓毒症更敏感，死亡率更高。临床研究报道，脓毒症患者中肥胖个体比正常体重者死亡风险更大。鉴于这些发现，疾病相关肥胖人群值得重点研究。本研究发现，小鼠卵巢切除和脓毒症导致全身炎症升高、Ang/Tie2信号失调、TJ蛋白减少、肺金属离子平衡紊乱。骨化三醇治疗逆转卵巢切除和脓毒症诱导的肺Ang/Tie2失衡，减轻铁死亡和铜死亡。TJ水平增加和组织学发现表明肺泡毛细血管屏障完整性和肺损伤改善。

本研究测量了几种血浆生物标志物。CXCL10是感染和炎症期间产生的趋化因子，调节淋巴细胞活化。MCP-1和MCP-3主要位于肺上皮，与中性粒细胞活化和运输及肺损伤发病机制相关。IL-22在多种组织包括肺中鉴定，调节屏障表面宿主防御和组织再生。本研究结果显示卵巢切除+脓毒症导致这些标志物升高，表明肺炎症和上皮损伤。骨化三醇治疗组CXCL10、MCP-1和MCP-3降低、IL-22更高，提示肺组织炎症和屏障损伤减轻。

脓毒症病理生理是高度复杂的反应，涉及多种细胞类型、炎症介质和相关调节系统激活。内皮在脓毒症宿主反应中起关键作用。血管内皮功能障碍与弥漫性毛细血管渗漏和脓毒症诱导器官损伤严重程度相关。Ang/Tie2通路是与内皮损伤相关的重要机制之一。Angs是血管发育和血管生成中重要的蛋白质。Ang1稳定内皮、抑制炎症和血管渗漏，而Ang2与Ang1作用相反，破坏微血管完整性，导致血管渗漏和终末器官功能障碍。Tie2是Ang蛋白的受体，独家表达于内皮。Ang1/Tie2信号促进内皮细胞存活和血管完整性。相反，Ang2在炎症和感染期间作为Ang1/Tie2信号竞争性拮抗剂。既往临床研究发现循环Ang2升高与肺血管渗漏和脓毒症死亡率增加相关。Ang2/Ang1和Ang1/Tie2比值对脓毒症患者临床结局有预后意义。本研究结果显示骨化三醇治疗组Ang1和Tie2水平及Ang1/Tie2比值更高。与这些发现一致，骨化三醇给药组VEGF和TJ蛋白水平升高。VEGF是促进血管内皮细胞生长的血管生成因子。Claudin-5、occludin和ZO-1是由上皮和内皮细胞表达的TJ蛋白。Claudin-5是膜蛋白和TJ关键组分。Occludin是定位於双细胞连接的跨膜蛋白。ZO-1含多个结构域，结合并组织其他连接组分，维持屏障稳态和功能。既往研究发现这些TJ蛋白表达增加改善内皮和上皮屏障功能。这些发现表明骨化三醇给药减轻肺内皮损伤，改善肺泡毛细血管屏障功能。

由于铁死亡和铜死亡与脓毒症诱导ALI密切相关，我们分析了肺组织铁死亡和铜死亡相关几种组分，评估骨化三醇对铁和铜稳态的影响。铁死亡主要源于铁依赖性磷脂过氧化，与GSH耗竭、GPX4抑制和活性氧（ROS）积累相关。另一方面，TFRC促进铁转运入细胞，助长铁死亡。ACSL4将PUFAs转化为酰基CoA衍生物，从而作为脂质过氧化底物。PTGS2是将花生四烯酸代谢为前列腺素的关键酶，在氧化应激下上调。TFRC、ACSL4和PTGS2广泛用作铁死亡生物标志物。FSP-1是GSH非依赖性自由基清除剂，防止铁死亡。SLC7A11是胱氨酸转运体，促进GSH生物合成和抗氧化防御。Nrf2是细胞维持适当氧化还原稳态的关键调节因子。Nrf2上调防止脂质过氧化和铁死亡。本研究发现VD治疗组Fe²⁺水平和TFRC、ACSL4、PTGS2表达更低，而保护性抗氧化组分包括FSP-1、SLC7A11、Nrf2、GSH和GPX4上调。这些发现表明骨化三醇给药后CLP后氧化还原反应更平衡，铁死亡减轻。

至于肺铜死亡，评估了几种重要调节组分。DLAT是丙酮酸脱氢酶复合体的必需亚基。过量细胞内铜靶向并结合脂酰化DLAT，导致蛋白毒性应激和铜死亡。LIAS是硫辛酸通路组分。FDX1作为还原酶将Cu²⁺还原为Cu⁺，直接结合脂酰化蛋白。DLAT、LIAS和FDX1密切相关。基因敲除研究报道FDX1和LIAS缺失导致蛋白脂酰化减少并阻止铜死亡。ATP7A/B和SLC31A1是调节细胞内铜稳态的铜转运体。ATP7A/B是铜输出器，而SLC31A1输入铜。一项研究显示ATP7B缺失或SLC31A1过表达导致铜积聚和细胞死亡。本研究发现骨化三醇治疗组肺Cu²⁺浓度和FDX1、LIAS、DLAT、SLC31A1表达水平降低，而ATP7A增加。这些发现表明骨化三醇可能参与减轻铜超载，缓解卵巢切除合并脓毒症诱导的肺铜死亡。

骨化三醇减轻ALI的有利作用机制可能部分源于VD与VDR的相互作用。骨化三醇是高亲和力配体，可直接激活VDR。骨化三醇/VDR信号激活增加TJ蛋白表达，改善屏障功能。既往研究显示VDR缺失导致肺屏障完整性破坏和肺通透性增加。另一方面，VDR也被报道减轻铁死亡变化，从而提供对抗器官损伤的保护。目前尚无研究探讨VD对铜死亡的作用。尽管本研究显示铜死亡在骨化三醇治疗组被抑制，但这些发现可能源于铁死亡抑制。铁死亡和铜死亡在信号通路方面密切相关，铁死亡诱导剂可增强铜死亡。VD治疗衍生的改善氧化还原状态和抗炎效应可能有助于减轻铁死亡和铜死亡，改善肺屏障完整性。组织学发现也表明脓毒症后骨化三醇给药肺损伤减轻。

本研究存在局限性。首先，由于CLP诱导脓毒症是公认具临床意义的模型，未纳入仅卵巢切除无CLP组。另一方面，缺乏假卵巢切除-CLP组限制区分卵巢切除在该脓毒症模型中的孤立效应。因此，当前设计反映卵巢切除和脓毒症的累积效应，而非将结局归因于任一条件单独作用。其次，研究聚焦骨化三醇治疗对肥胖小鼠的影响。瘦和肥胖表型在卵巢切除和脓毒症条件下对骨化三醇的潜在差异反应尚未探索，值得进一步研究。

总之，本研究首次表明卵巢切除合并脓毒症导致Ang/Tie2轴失调和屏障功能损害。同时，肺组织出现铁死亡和铜死亡。骨化三醇给药引发更平衡的Ang/Tie信号，改善肺屏障功能。骨化三醇治疗组还观察到金属离子超载减轻、铁死亡和铜死亡缓解以及生存增强。本研究提示骨化三醇治疗可能对老年肥胖女性脓毒症并发症ALI具有潜在治疗重要性。