六聚体终止因子Rho中ATP结合位点完整与部分形成状态下的同步配体结合研究

本刊推荐：为解决寡聚蛋白配体结合复杂性难以解析的问题，研究人员以大肠杆菌终止因子Rho为模型，采用天然质谱技术开展ATP结合特性研究。结果首次观测到六聚体及低阶寡聚体的ATP结合行为，并发现部分形成结合位点的超化学计量结合现象，为阐明六聚体解旋酶能量转化机制提供了关键热力学见解。

　　

在分子生物学的精密世界里，六聚体解旋酶如同高效的分子马达，通过水解核苷三磷酸（NTP）沿着核酸链定向转运，执行转录终止、DNA复制等关键生命过程。然而，深入理解这些复杂机器的运作机制面临一个重大挑战：它们由多个亚基组装而成，存在复杂的寡聚化状态，传统的配体结合测量方法难以区分不同寡聚体各自的结合行为，得到的信号往往是多种结合等温线叠加的“混合体”，使得精确解析结合位点间的热力学耦合变得异常困难。大肠杆菌（E. coli）的转录终止因子Rho正是这样一个典型的六聚体解旋酶。长期以来，对其ATP结合特性的研究一直存在争议，例如荧光结合实验观察到多相性结合等温线，曾被解释为存在三个“强”和三个“弱”结合位点，但实验信号是否完全源于六聚体形式，以及寡聚体组装状态变化是否影响结合测量，始终是悬而未决的问题。为了突破这一瓶颈，揭示Rho蛋白协调ATP结合、水解与功能执行的内在规律，研究人员迫切需要一种能够“直视”不同寡聚体各自配体结合状态的新技术。

为此，发表在《Journal of Biological Chemistry》上的这项研究，巧妙地运用了天然质谱（native mass spectrometry, nMS）这一强大工具。研究团队旨在精确测量ATP与异质性寡聚体状态的Rho蛋白的结合过程，以期获得以往方法无法提供的微观结合信息，从而为理解六聚体解旋酶的能量转化机制奠定坚实的理论基础。

研究人员为开展本研究，主要应用了以下几项关键技术：通过重组表达和色谱技术纯化获得E. coli Rho蛋白；利用分析型尺寸排阻色谱（SEC）和质谱测光法（MP）表征溶液中和气溶胶状态下Rho蛋白的单体至六聚体的异质性寡聚状态分布；核心实验采用天然质谱（nMS）技术，在接近生理条件的缓冲液中，对Rho蛋白与不同浓度ATP的混合物进行“软电离”质谱分析，直接观测并定量不同寡聚体状态（单体至六聚体）结合ATP的数量和种群分布；最后通过数据分析和模型拟合（如线性最近邻模型）来阐释结合模式。

结果与讨论

Rho在溶液和气相中呈现多种寡聚状态

研究首先确认了Rho蛋白在生化相关浓度下确实存在复杂的寡聚化平衡。纳米电喷雾电离（nano-electrospray ionization）的天然质谱图清晰地展示了一系列离子信号，分别对应于单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体和六聚体。每种寡聚体都呈现出狭窄的电荷态分布，表明其在气相中保持了天然类似的结构。溶液中的实验进一步佐证了这种异质性：尺寸排阻色谱（SEC）显示，Rho的洗脱体积随蛋白浓度（从0.1 μM到10 μM）变化而显著移动，表明平均寡聚状态发生改变。更灵敏的质谱测光法（MP）在0.1 μM的Rho浓度下，直接检测到从单体（47 kDa）到六聚体（283 kDa）的多种颗粒计数分布，其中单体和六聚体的颗粒数最多，提示自组装过程可能存在弱正协同性。重要的是，在亚毫摩尔浓度的ATP存在下，寡聚体种群分布未受明显影响，表明ATP结合主要发生在预先形成的寡聚体上，而非通过改变组装平衡来间接影响。

天然质谱实现对各Rho寡聚体状态ATP结合的同时测量

研究的核心发现来自于利用nMS同时监测不同寡聚体状态的ATP结合。在优化条件以减少盐分/溶剂加合物形成后，研究人员在不同ATP浓度（0至100 μM）下获取了nMS谱图。令人振奋的是，对于每一种寡聚体（如二聚体、三聚体等），谱图上都清晰地分辨出结合了不同数量ATP的离子信号（质量偏移对应于ATP的结合，约+507 Da，若为单钠加合则为+530 Da）。这种能力使得研究人员能够独立地、并行地追踪每个寡聚体家族的配体占据情况，这是传统一维测量方法无法企及的。

观察到与结合位点结构完整性一致的配体结合模式及超化学计量结合

对结合数据的详细分析揭示了与寡聚体结构密切相关的结合模式。在每个Rho寡聚体中，一个完整的ATP结合位点主要由一个亚基贡献约80%的埋藏配体表面积，相邻亚基贡献剩余的20%。因此，对于一个二聚体，只能形成一个完整的界面结合位点，同时两端还暴露着两个形成不完全的“边缘”位点。实验观察与此完美吻合：在10 μM ATP下，二聚体主要结合一个ATP（对应于完整位点），少量结合两个ATP，极少量结合三个。类似地，三聚体、四聚体也显示出对其内部完整位点的优先占据，而对边缘位点的占据随ATP浓度升高而增加。更为有趣的是，研究首次观察到了“超化学计量”结合现象，即五聚体和六聚体在较高ATP浓度下（分别从40 μM和100 μM开始），其结合ATP的数量超过了其亚基数目（即分别超过5个和6个）。这直接证实了在六聚体开放环状结构（open washer structure）的边缘，那些部分形成的结合位点同样具备结合ATP的能力。这一发现为理解先前关于Rho存在不同亲和力结合位点的报道提供了新的结构视角。

对结合数据的初步模型拟合与意义探讨

作为迈向机理阐释的第一步，研究人员尝试将六聚体的结合数据拟合到一个包含六个位点的线性最近邻模型中。初步拟合结果表明，相邻位点间的耦合对内在ATP结合亲和力产生负贡献。这些详细的、按寡聚体种类区分的结合种群数据，突显了传统测量方法将来自不同寡聚体的结合信号平均化后所掩盖的复杂性。nMS所提供的这种高分辨率结合信息，对于未来建立精确的统计热力学模型，以最终阐明Rho以及其他六聚体解旋酶中NTP周转如何协调其进行性转运功能至关重要。

本研究通过天然质谱技术，成功实现了对异质性寡聚蛋白Rho与其配体ATP结合过程的“可视化”解析。研究不仅直接观测并量化了ATP与从单体到六聚体各种Rho寡聚体的结合，更重要的是，发现了超化学计量结合现象，证实了部分形成的边缘结合位点的功能活性。这些发现解决了长期以来关于Rho蛋白ATP结合模式的争议，揭示了传统平均化测量方法的局限性。该研究凸显了天然质谱在解析复杂生物大分子体系配体结合热力学方面的独特优势，为最终阐明六聚体解旋酶如何利用配体结合、水解和交换的自由能来协调其功能提供了关键的数据支持和新的研究范式。这项成果对于理解一大类依赖于核苷酸水解的分子机器的运作机制具有普遍意义。