Fusobacterium nucleatum通过经典电子转移黄素蛋白（ETF）实现乳酸氧化与丁酰辅酶A形成的直接偶联机制解析及其在氧化应激应答中的生理意义

本研究揭示了机会致病菌Fusobacterium nucleatum通过其lct基因簇编码的经典电子转移黄素蛋白（ETFFN），直接偶联D-乳酸氧化与巴豆酰辅酶A还原反应的能量代谢新机制。研究人员通过酶动力学、光谱分析和氧化还原滴定技术，证实ETFFN以非分支机制高效传递电子，其紧密且负值的氧化还原电位（FAD/FAD•-为-70 mV，FAD•-/FADH-为-122 mV）完美适配生理环境。该通路不仅为细菌在氧化应激下维持 redox 稳态提供了新策略，更为理解厌氧菌代谢适应性提供了分子基础。

　　

在人体微生物组中，Fusobacterium nucleatum（具核梭杆菌）作为一种革兰阴性厌氧机会致病菌，不仅与牙周疾病密切相关，还被发现存在于结直肠癌组织内，其代谢适应性成为致病性的关键因素。厌氧菌在面临氧化应激时，如何维持细胞内氧化还原平衡（redox homeostasis）是其生存的核心科学问题。传统认知中，电子转移黄素蛋白（Electron Transfer Flavoprotein, ETF）主要分为两类：经典ETF（canonical ETF）参与线粒体脂肪酸β-氧化中的电子传递，而分叉ETF（bifurcating ETF）则能通过黄素基电子分叉（flavin-based electron bifurcation）机制，耦合放能反应与吸能反应，实现能量守恒。然而，F. nucleatum基因组中编码了两套ETF系统，其中一套与D-乳酸脱氢酶（Ldh）、丁酰辅酶A脱氢酶（Bcd）及LrgAB蛋白共同组成一个6基因簇（即lct基因簇），且该簇受氧化应激应答调控因子ModRS的调控。这提示该基因簇可能通过独特的电子传递机制，在氧化应激下发挥维持 redox 平衡的作用。但是，该ETF究竟属于经典还是分叉类型？其如何偶联乳酸氧化与丁酰辅酶A形成？这种偶联对细菌应对氧化压力有何生理意义？这些关键问题尚未阐明。

为了回答这些问题，加拿大不列颠哥伦比亚大学的研究团队在《Journal of Biological Chemistry》上发表了一项研究，他们通过异源表达纯化了F. nucleatum的ETF_FN、Ldh_FN和Bcd_FN蛋白，综合运用稳态与预稳态酶动力学分析、停流光谱（stopped-flow spectroscopy）、氧化还原滴定（redox potentiometry）及多变量曲线分辨率-交替最小二乘法（MCR-ALS）分析等技术，系统解析了该系统的催化特性、氧化还原性质及生理功能。

研究人员首先通过序列比对发现，lct基因簇编码的ETF_FN的β亚基中，第130位为苯丙氨酸（Phe130），而非分叉ETF中保守的甘氨酸（Gly123），这提示其可能结合AMP而非FAD，属于经典ETF。随后，他们纯化了ETF_FN，其紫外-可见光谱显示出黄素蛋白的特征吸收峰（λ_max at 389 and 440 nm），且热变性后释放的辅基经鉴定为FAD，辅基与蛋白的比例为0.5:1，符合经典ETF的特征。

在表征Ldh_FN的动力学性质时，预稳态实验表明，该酶优先催化D-乳酸氧化（对L-乳酸亲和力很低），其还原过程呈双相动力学特征，快速相的限速常数（k_lim）为16.7 s^-1，解离常数（K_D）为290 μM。稳态分析以细胞色素c³⁺为电子受体，测得对D-乳酸的K_M为35.0 μM，k_cat为2.76 s^-1。当加入ETF_FN后，酶促反应速率显著提升（k_cat增至68.5 s^-1），表明ETF_FN能高效接受来自Ldh_FN的电子。

关键的整体反应（乳酸 + 巴豆酰辅酶A → 丙酮酸 + 丁酰辅酶A）通过耦合酶标法得到验证。实验结果显示，该反应对D-乳酸的K_M极低（0.65 μM），对巴豆酰辅酶A的K_M为5.2 μM，催化效率高达10⁵-10⁶ M^-1 s^-1级，表明该系统在生理浓度底物下即可高效运行。值得注意的是，反向反应（丙酮酸 + 丁酰辅酶A → 乳酸 + 巴豆酰辅酶A）未能检测到，提示反应的热力学驱动方向不可逆。

氧化还原滴定结合MCR-ALS分析揭示了ETF_FN中α-FAD的独特性质：其两个单电子还原步骤的电位分别为-70 mV（FAD/FAD^•-）和-122 mV（FAD^•-/FADH^-），两者仅相差52 mV，且均较其他报道的ETF更负。这种紧密且负的电位配置使得ETF_FN在生理环境下倾向于以完全还原（双电子还原）形式存在，从而高效接收来自Ldh_FN的两个电子。与之相比，Ldh_FN的FAD电位更为接近（-109 mV和-115 mV），也支持双电子传递。

研究人员在讨论中强调，该经典ETF偶联机制与分叉ETF系统（如Megasphaera elsdenii中的Bcd-ETF复合物）存在本质区别。分叉ETF可能因在氧存在下表现出NADH氧化酶活性，产生超氧阴离子（O₂^•-）和过氧化氢（H₂O₂），而经典ETF的使用可能是F. nucleatum避免产生活性氧物种（reactive oxygen species, ROS）的一种适应性策略。此外，该lct基因簇的上游受ModRS调控，后者是氧化应激应答的全局调控因子。因此，在氧化压力下，上调该通路可能通过增加丁酰辅酶A的生成，进而被丁酰辅酶A氧氧化还原酶（Butyryl-CoA Oxygen Oxidoreductase, BOOR）利用，将电子传递给O₂生成H₂O，从而安全地消耗氧气并维持细胞内redox稳态。

综上所述，本研究首次揭示了F. nucleatum利用经典ETF直接偶联乳酸氧化与丁酰辅酶A生成的新型代谢通路，并阐明了其独特的氧化还原特性。这不仅为理解厌氧菌在宿主环境中应对氧化压力的分子机制提供了新视角，也为针对其代谢脆弱性开发新的抗菌策略提供了潜在靶点。