拟南芥HSP90.7的pre-N与C端延伸区调控分子伴侣活性及内质网应激响应的机制研究

本研究针对植物内质网分子伴侣HSP90.7功能调控机制不明确的问题，系统解析了其pre-N与C端延伸区（CTE）在ATP酶活性、底物结合以及应激响应中的关键作用。通过分子动力学模拟、体外生化实验和体内突变体分析，发现这两个区域虽在正常生长中非必需，但在内质网应激条件下显著影响HSP90.7的分子伴侣功能与植物抗逆性，为理解植物蛋白质稳态调控提供了新视角。

　　

内质网（Endoplasmic Reticulum, ER）是真核细胞中蛋白质合成、折叠与质量调控的核心场所，其稳态维持对细胞功能至关重要。当受到环境胁迫或内部失衡影响时，内质网中未折叠或错误折叠蛋白累积，引发内质网应激（ER stress），并激活未折叠蛋白反应（Unfolded Protein Response, UPR）。分子伴侣在这一过程中发挥关键作用，其中HSP90家族蛋白广泛参与客户蛋白的折叠、稳定与激活。拟南芥中的HSP90.7（也称为SHEPHERD）是一种内质网定位的HSP90同源物，已知在植物发育、蛋白质成熟以及应激响应中具有重要作用，然而其具体调控机制，尤其是其特殊的N端前导区域（pre-N）和C端延伸区（C-terminal extension, CTE）的功能仍不清楚。

为探究HSP90.7中pre-N与CTE的生物学功能，研究人员来自多伦多大学士嘉堡分校生物科学系，综合运用分子动力学模拟、体外生物化学实验以及体内突变体分析等多种方法，系统阐述了这两个区域在调节HSP90.7的ATP酶活性、分子伴侣功能以及植物对内质网应激的耐受性中的重要作用。该研究论文发表在《Journal of Biological Chemistry》上，为认识植物特异的分子伴侣调控机制提供了新见解。

在研究过程中，作者主要采用了以下几种关键技术方法：一是利用AlphaFold3进行蛋白质结构预测与分子动力学模拟，分析pre-N与CTE的结构动态；二是通过体外表达与纯化获得HSP90.7及其缺失突变体蛋白，并测定其ATP酶活性与底物结合能力；三是构建拟南芥转基因株系，在HSP90.7敲除背景下回补pre-N或CTE缺失突变体，观察其在正常生长与内质网应激处理（如衣霉素tunicamycin和钙螯合剂EGTA）下的表型变化；此外，还使用尺寸排阻色谱分析蛋白在植物体内的复合体状态，并通过免疫印迹验证蛋白表达。

研究结果部分主要包括以下内容：

ER-localized Arabidopsis HSP90.7 contains a conserved pre-N region

通过AlphaFold3结构预测，发现HSP90.7形成二聚体，其pre-N与CTE区域均为内在无序区域，pre-N在物种间具有较高保守性，而CTE在植物与哺乳动物之间序列差异较大。植物HSP90.7的CTE中不存在哺乳动物GRP94中特有的“strap”酸性基序，暗示其功能可能存在分化。

Pre-N and CTE introduce structural flexibility

分子动力学模拟表明，pre-N与CTE的缺失并不影响HSP90.7二聚体的整体稳定性，但改变了中间域（MD）和C端域（CTD）的构象动态。pre-N缺失降低了MD与CTD的移动性，而CTE缺失则增加了MD的灵活性。此外，pre-N与CTE均能与HSP90.7的核心域发生动态接触，提示它们可能作为构象调节模块，影响 chaperone 循环。

Both pre-N and CTE regions regulate HSP90.7 chaperone activity

ATP酶活性实验显示，pre-N缺失突变体（HSP90.7ΔpN及双突变体）的ATP水解活性显著升高，周转速率（k_cat）提高约1.6–2.0倍，米氏常数（K_M）降低2–3倍，说明pre-N抑制ATP酶活性。而CTE缺失并不影响ATP水解。在底物结合实验中，CTE缺失显著削弱了HSP90.7的抗聚集（holdase）活性，而pre-N缺失反而增强了该活性，双突变则部分恢复功能，表明两个区域在调节客户蛋白结合中具有相互协调的作用。

Pre-N and CTE regions are dispensable under normal plant growth conditions

在正常生长条件下，表达pre-N或CTE缺失突变体的转基因植株与野生型无明显差异，包括种子萌发、幼苗建成、根系生长以及生殖发育等方面均正常，说明这两个区域在基础生长中并非必需。

Pre-N and CTE regions are critical for HSP90.7 function under ER stress conditions

在衣霉素诱导的内质网应激和EGTA介导的低钙胁迫下，pre-N或CTE缺失突变植株表现出明显的应激超敏表型，叶片白化严重，恢复能力减弱。分子尺寸排阻色谱进一步显示，CTE缺失突变体在植物体内形成的蛋白复合体更小，提示其客户蛋白结合能力受损。

综合以上结果，研究得出结论：pre-N与CTE区域虽然不参与HSP90.7在正常条件下的基本功能，但在内质网应激响应中发挥关键作用。pre-N作为ATP酶活性的负调控模块，减缓ATP水解速率，可能有助于维持 chaperone 与客户蛋白的稳定结合；而CTE则主要通过维持二聚体稳定性和客户蛋白结合能力，增强分子伴侣的抗应激功能。两者在功能上相互补充，协同调控HSP90.7的构象循环与应激保护机制。

该研究不仅深化了对植物内质网分子伴侣功能调控的理解，也为利用HSP90.7改良作物抗逆性提供了潜在分子靶点。此外，pre-N功能在哺乳动物GRP94中的保守性也提示HSP90家族在不同细胞环境中可能共享类似的调控策略。